5-氟尿嘧啶作用人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721后殘存細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞比例增加

朱雯靜，楊 玥，郝溥辰，李德龍，趙 森，陳培瓊，俞 亮，薛 冉，史 亮，王子乾，呂福東，馮驥良

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)七年制研究生;3.中國(guó)人民解放軍第306醫(yī)院;4.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院;5.首都醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第六大多發(fā)癌癥，死亡率居腫瘤死亡率第三位［1］。42.5%的原發(fā)性肝癌發(fā)生在中國(guó)大陸，它已成為我國(guó)第二位惡性腫瘤病因［2］。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出為腫瘤研究與治療帶來(lái)了希望。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為［3-5］，腫瘤中存在一小群表達(dá)干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的能力。這些細(xì)胞能夠逃避常規(guī)治療方案的殺傷作用，從而導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［6-7］。腫瘤干細(xì)胞具有和成體干細(xì)胞相似的自我更新和自我分化潛能，應(yīng)用正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的這一相似之處，人們開(kāi)始以正常干細(xì)胞的標(biāo)志分子來(lái)篩選腫瘤干細(xì)胞。已報(bào)道的存在腫瘤干細(xì)胞的組織類(lèi)型腫瘤有急性髓性白血病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌和前列腺癌等［8-11］。

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)可能是一種具有普遍性的腫瘤發(fā)生機(jī)制，以往研究證實(shí)肝癌中也存在肝癌干細(xì)胞［12-13］。它們與正常肝干細(xì)胞共同表達(dá)一些表面標(biāo)志物，如 AFP、CD133、ABCG2、CK7、Thy-1、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、CD44等［14-18］。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)5-FU作用BEL-7402肝癌細(xì)胞后細(xì)胞間黏附分子-1/CD54和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)/CD56陽(yáng)性細(xì)胞比例增加，且通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)ICAM-1和NCAM可能成為肝癌干細(xì)胞的候選標(biāo)志物［19］。但是肝癌具有明顯的異質(zhì)性［15］，不同肝癌臨床病例和不同肝癌細(xì)胞系中腫瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞生物學(xué)特性不同，對(duì)藥物作用的反應(yīng)也不相同。我們?cè)?-FU作用BEL-7402細(xì)胞系的模型中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的富集現(xiàn)象，并推測(cè)在臨床治療中十分常見(jiàn)的5-FU化療后耐藥所引起的腫瘤復(fù)發(fā)，很有可能與肝癌干細(xì)胞逃逸5-FU的單藥物殺傷有關(guān)。但5-FU在其他肝癌細(xì)胞系中是否也具有同樣作用還不得而知。

本研究中我們選擇了SMMC-7721細(xì)胞系。與BEL-7402細(xì)胞系比較，雖然兩者形態(tài)學(xué)特點(diǎn)相似，染色體個(gè)數(shù)相近，AFP均陽(yáng)性表達(dá)，且兩者接種裸鼠均可形成瘤結(jié)節(jié)，但BEL-7402在裸鼠移植成瘤實(shí)驗(yàn)中需要的瘤細(xì)胞數(shù)目更少且生長(zhǎng)速度更快［20-21］。這些證據(jù)表明，與BEL-7402細(xì)胞系比較，SMMC-7721細(xì)胞系可能惡性轉(zhuǎn)化自較成熟的肝細(xì)胞。因此，本研究采用了SMMC-7721細(xì)胞系，同時(shí)引入了更多的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，如 NCAM、ICAM-1、EpCAM、CD133及 ABCG2，旨在進(jìn)一步探討肝癌干細(xì)胞逃避藥物殺傷與臨床化療失敗的關(guān)系，為肝癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721由我?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院安威教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑:RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于 Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季清公司，CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，5-FU試劑購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)公司。

1.1.3 抗體:ICAM-1-異硫氰酸熒光素(FITC)、Ep-CAM-藻紅蛋白(PE)、NCAM-Cy5單克隆熒光抗體購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司，CD133-FITC單克隆熒光抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)5-FU對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系增殖的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721肝癌細(xì)胞株，0.25%胰蛋白酶消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置6組不同5-FU濃度的實(shí)驗(yàn)組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置四個(gè)復(fù)孔。調(diào)節(jié)5-FU終濃度分別為0.1、1、10、25、50 μg/mL。同時(shí)設(shè)不加任何藥物的對(duì)照組。5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36、48 h加入CCK-810 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后以450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔吸光度值。計(jì)算藥物5-FU對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響。

1.2.2 測(cè)定5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞系后對(duì)細(xì)胞周期的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SMMC-7721細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心 10 min，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基RPMI-1640配成細(xì)胞懸浮液，稀釋至5×104個(gè)細(xì)胞/mL。以5-FU終濃度為10 μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不含藥物的對(duì)照組。48 h后取106～107個(gè)細(xì)胞4℃ 70%冷乙醇固定，加入含2%RNase和1‰Triton×100的PBS緩沖液1 mL，水浴30 min，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.3 SMMC-7721細(xì)胞系表面標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的檢測(cè):取培養(yǎng)48 h的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，培養(yǎng)方法與1.2.2相同。0.25%胰蛋白酶消化，離心，PBS稀釋至細(xì)胞密度為2×106/mL。取流式細(xì)胞檢測(cè)加樣管10支，每支加入10 μL HEPES溶液，20 μL 滅活胎牛血清，其中5支每支加入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液100 μL，另5支加入對(duì)照組細(xì)胞懸液100 μL。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均分別加入EpCAM-PE熒光抗體3 μL，NCAM-Cy5熒光抗體 1 μL，ICAM-1-FITC 熒光抗體 4 μL，CD133-FITC熒光抗體10 μL和 ABCG2-PE熒光抗體2 μL，1500 r/min離心兩次，每次3 min。500 μL PBS懸浮，400目濾網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，n≥3，細(xì)胞周期及表面標(biāo)志物檢測(cè)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，增殖曲線經(jīng)Mauchly“球?qū)ΨQ(chēng)”檢驗(yàn)后采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5-FU處理前后細(xì)胞增殖能力的變化 CCK-8試劑盒細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)Mauchly“球?qū)ΨQ(chēng)”檢驗(yàn)結(jié)果P=0.57，接受“球?qū)ΨQ(chēng)”假設(shè)。各時(shí)間點(diǎn)之間吸光度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);組間相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);藥物濃度與藥物作用時(shí)間之間存在交互作用(P=0.000)。說(shuō)明5-FU的藥物毒性使SMMC-7721細(xì)胞系增殖明顯減弱，5-FU對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖水平的抑制作用具有時(shí)間依賴(lài)性以及劑量依賴(lài)性，即隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。

2.2 5-FU藥物處理前后細(xì)胞周期的變化(n=3) 使用10 μg/mL的5-FU濃度進(jìn)行細(xì)胞周期與陽(yáng)性細(xì)胞比例變化的研究，作用時(shí)間為48 h。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，5-FU處理使SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞周期分布變化明顯，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例為 83.917% ±12.996%，較對(duì)照組 46.617% ±18.857%明顯升高，S期細(xì)胞比例由對(duì)照組的50.510% ±16.405% 下降至實(shí)驗(yàn)組的 15.360% ±13.517%，G2/M期細(xì)胞比例由對(duì)照組的2.872% ±2.824%下降至實(shí)驗(yàn)組的0.722% ±0.711%。表明5-FU對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期各期細(xì)胞比例均有影響，G0/G1期、S期和G2/M期在5-FU作用前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，G0/G1期阻滯明顯(見(jiàn)圖2、圖3)。

圖1 不同濃度的5-FU作用于SMMC-7721細(xì)胞系后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化Fig 1 Treatment with 5-FU on the growth of SMMC-7721 cells with different concentrations

圖2 10 μg/mL 5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞前后對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期變化 A:對(duì)照組細(xì)胞周期分布:G0/G1期:46.617% ±18.857%;S 期:50.510% ±16.405%;G2/M 期:2.872% ±2.824%;B:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布:G0/G1期:83.917% ±12.996%;S 期:15.360% ±13.517%;G2/M 期:0.722% ±0.711%Fig 2 Effects of 5-FU on the cell cycle distribution of SMMC-7721 with the concentration of 10 μg/mL for 48 h

圖3 10 μg/mL 5-FU作用48 h處理前后，SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞周期分布變化(*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Fig 3 Treatment with 5-FU on the cell cycle distribution of SMMC-7721 cells with the concentration of 10 μg/mL for 48 h

2.3 5-FU藥物處理前后細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)比率變化 流式細(xì)胞儀特定表面抗原測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，5-FU處理使SMMC-7721細(xì)胞表面的干細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率變化明顯。實(shí)驗(yàn)組 NCAM、ICAM-1、EpCAM、CD133、ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為7.2% ±0.1%，94.6% ±0.1%、5.4% ±0.3%、17.5% ±0.4%、1.8% ± 0.1%。較對(duì)照組分別為 0.6% ± 0、78.0% ±0.9%、3.9% ±0.1%、8.2% ± 0.6%、0.3% ± 0.1%，均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明5-FU處理能夠提高殘存細(xì)胞中表達(dá)這些標(biāo)志物的細(xì)胞比例(見(jiàn)圖4、圖5)。

圖4 10 μg/mL 5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞48 h后，幾種肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)變化(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)Fig 4 Effects of 5-FU on the positive cells proportion of SMMC-7721 with the concentration of 10 μg/mL for 48 h

3 討論

5-FU是臨床上治療肝癌的一線化療藥物。以往研究表明，5-FU可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖［22-25］，但在臨床肝癌治療中對(duì)5-FU的耐藥現(xiàn)象比較普遍，分子機(jī)理尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)5-FU對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用存在時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性，但實(shí)驗(yàn)組各濃度5-FU均無(wú)法完全抑制SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)，始終會(huì)有部分細(xì)胞逃逸藥物的殺傷作用。在這些殘存的腫瘤細(xì)胞中，腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物NCAM、ICAM-1、EpCAM、CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例均較未加藥對(duì)照組明顯升高，表明同5-FU作用BEL-7402肝癌細(xì)胞模型一樣［19］，一定劑量5-FU作用 SMMC-7721細(xì)胞后，殘存細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞的比例明顯增加。NCAM、ICAM-1、EpCAM是三種細(xì)胞黏附分子，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中作用十分重要［26-28］。CD133是一種腫瘤干細(xì)胞的廣譜標(biāo)志物，尤其是在分化差的腫瘤組織中CD133表達(dá)更強(qiáng)。通過(guò)對(duì)兩細(xì)胞系比較研究發(fā)現(xiàn)，雖然各細(xì)胞系5-FU單藥物作用前后上述4種表面標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞比例存在顯著差異，但在BEL-7402與SMMC-7721兩細(xì)胞系之間，處理前后細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率存在不同程度變化。不同生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞系之間其腫瘤干細(xì)胞的比例和種類(lèi)可能是不同的。正是由于腫瘤干細(xì)胞異質(zhì)性的存在而導(dǎo)致了臨床上肝細(xì)胞癌不同患者之間腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移的能力不同。這提示未來(lái)對(duì)腫瘤的個(gè)體化治療具有重要意義。

圖5 10 μg/mL 5-FU作用SMMC-7721細(xì)胞48 h處理前后對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面標(biāo)志物陽(yáng)性率比較A、B:NCAM;C、D:ICAM-1;E、F:EpCAM;G、H:CD133;I、J:ABCG2;A、C、E、G、I:對(duì)照組;B、D、F、H、J:實(shí)驗(yàn)組Fig 5 Several surface markers expression profiles in control and test group treated with 5-FU with the concentration of 10 μg/mL for 48 h

通過(guò)分析5-FU作用后的殘存細(xì)胞的周期分布發(fā)現(xiàn)，靜息期(G0/G1期)細(xì)胞在細(xì)胞群中比例明顯上升。5-FU主要通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)的活性，阻斷尿嘧啶脫氧核苷向胸腺嘧啶脫氧核苷的轉(zhuǎn)變，從而影響細(xì)胞內(nèi)的DNA與RNA的合成［22］。它對(duì)細(xì)胞周期中的各期都有毒性作用，尤其是S期，殘存細(xì)胞多處于G0/G1期［29］。大量研究表明，腫瘤干細(xì)胞與人正常干細(xì)胞相似，處于靜息的G0期。ABCG2屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一，在許多組織類(lèi)型的正常干細(xì)胞膜上高表達(dá)，通過(guò)“ABCG2泵”排出藥物以避免藥物對(duì)自身的殺傷作用［30］。5-FU作用SMMC-7721后殘存腫瘤細(xì)胞中ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞比例增加提示殘存細(xì)胞群體具有腫瘤干細(xì)胞特性。同時(shí)，殘存細(xì)胞群體中ICAM-1和NCAM陽(yáng)性細(xì)胞比例的增加表明這兩個(gè)黏附因子可以作為肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物［31-32］。

［1］Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］Wu MC.Progress on treatment of primary carcinoma of liver［J］.China Medical News，2002，1:10-11.吳孟超.原發(fā)性肝癌治療的進(jìn)展［J］.中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào)，2002，1:10-11.

［3］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［4］Al-Hajj M，Clarke MF.Self-renewal and solid tumor stem cells［J］.Oncogene，2004，23(43):7274-7282.

［5］Scadden DT.Cancer stem cells refined［J］.Nat Immunol，2004，5(7):701-703.

［6］Morgan J，Jackson JD，Zheng X，et al.Substrate affinity of photosensitizers derived from chlorophyll-a:the ABCG2 transporter affects the phototoxic response of side population stem cell-like cancer cells to photodynamic therapy［J］.Mol Pharm，2010 Sep1.

［7］Sell S.Cellular origin of hepatocellular carcinomas［J］.Semin Cell Dev Biol，2002，13(6):419-424.

［8］Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(7):3983-3988.

［9］Singh SK，Clarke ID，Hide T，et al.Cancer stem cells in nervous system tumors［J］.Oncogene，2004，23(43):7267-7273.

［10］Collins AT，Berry PA，Hyde C，et al.Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells［J］.Cancer Res，2005，65(23):10946-10951.

［11］Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］.Nat Med，1997，3(7):730-737.

［12］Mishra L，Banker T，Murray J，et al.Liver stem cells and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2009，49(1):318-329.

［13］Sell S，Leffert H.Liver cancer stem cells［J］.J Clin Oncol，2008，26(17):2800-2805.

［14］Yang XR，Xu Y，Yu B，et al.High expression levels of putative hepatic stem/progenitor cell biomarkers related to tumour angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Gut，2010，59(7):953-962.

［15］Zen Y，F(xiàn)ujii T，Yoshikawa S，et al.Histological and culture studies with respect to ABCG2 expression support the existence of a cancer cell hierarchy in human hepatocellular carcinoma［J］.Am J Pathol，2007，170(5):1750-1762.

［16］Yamashita T，F(xiàn)orgues M，Wang W，et al.EpCAM and alpha-fetoprotein expression defines novel prognostic subtypes of hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2008，68(5):1451-1461.

［17］Durnez A，Verslype C，Nevens F，et al.The clinicopathological and prognostic relevance of cytokeratin 7 and 19 expression in hepatocellular carcinoma.A possible progenitor cell origin［J］.Histopathology，2006，49(2):138-151.

［18］Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13(2):153-166.

［19］Yang Y，Li DL，Zhu WJ，et al.The effect of 5-fluorouracil on enriching cancer stem cells of hepatoma cell line BEL-7402［J］.Chin J Hepatol，2011，19(9):105-109.楊玥，李德龍，朱雯靜，等.5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌細(xì)胞系BEL-7402中腫瘤干細(xì)胞的富集作用［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(9):105-109.

［20］Chen RM，Zhu DH，Ye XZ，et al.Establishment and characteristic of BEL-7402［J］.Chinese Science Bulletin，1975，(9):434-436.陳瑞銘，朱德厚，葉秀珍，等.人體肝癌體外細(xì)胞株(BEL-7402)的建立及其特征［J］.科學(xué)通報(bào)，1975，(9):434-436.

［21］董榮春，周榮華，呂發(fā)度，等.SMMC-7721人體肝癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1980，(1):5-9.

［22］Violette S，Poulain L，Dussaulx E，et al.Resistance of colon cancer cells to long-term 5-fluorouracil exposure is correlated to the relative level of Bcl-2 and Bcl-X(L)in addition to Bax and p53 status［J］.Int J Cancer，2002，98(4):498-504.

［23］Jiang J，Liu J，Zhu J，et al.Mechanism of apoptotic effects induced by 5-fluorouracil on human liver carcinoma Bel7402 cell line［J］.Chin Med J(Engl)，2002，115(7):968-971.

［24］Tseng YS，Tzeng CC，Chiu AW，et al.Ha-ras overexpression mediated cell apoptosis in the presence of 5-fluorouracil［J］.Exp Cell Res，2003，288(2):403-414.

［25］Yang L，Wu D，Luo K，et al.Andrographolide enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis via caspase-8-dependent mitochondrial pathway involving p53 participation in hepatocellular carcinoma(SMMC-7721)cells［J］.Cancer Lett，2009，276(2):180-188.

［26］Yamashita T，Ji J，Budhu A，et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features［J］.Gastroenterology，2009，136(3):1012-1024.

［27］Terris B，Cavard C，Perret C.EpCAM，a new marker for cancer stem cells in hepatocellular carcinoma ［J］.J Hepatol，2010，52(2):280-281.

［28］Xu XL，Xing BC，Han HB，et al.The properties of tumor-initiating cells from a hepatocellular carcinoma patient’s primary and recurrent tumor［J］.Carcinogenesis，2010，31(2):167-174.

［29］Hodgson GS，Bradley TR.Properties of haematopoietic stem cells surviving 5-fluorouracil treatment:evidence for a pre-CFU-S cell［J］.Nature，1979，281(5730):381-382.

［30］Sarkadi B，Homolya L，Szakacs G，et al.Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters:participation in a chemoimmunity defense system［J］.Physiol Rev，2006，86(4):1179-1236.

［31］Hu J，Li J，Wang M，et al.Isolation of side population cells from gallbladder carcinoma of human being and the expression of ABCG2 gene［J］.Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2007，6(5):469-473.

［32］Monzani E，F(xiàn)acchetti F，Galmozzi E，et al.Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential［J］.Eur J Cancer，2007，43(5):935-946.