不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中CD標(biāo)志物的表達(dá)差異及意義

夏羽佳，余 帆，晏 維，劉 梅，田德安

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430030;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科

原發(fā)性肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于全部惡性腫瘤的第五位，中國(guó)是世界上肝癌死亡率最高的國(guó)家，占世界肝癌總死亡人數(shù)的53%。肝癌患者的預(yù)后極差，術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響肝癌遠(yuǎn)期療效的重要因素［1］。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤組織中并非所有腫瘤細(xì)胞都具有惡性特征，即存在極少量腫瘤細(xì)胞，具有自我更新和分化潛能，具有遷移、侵襲、成瘤特性，是腫瘤增殖生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源［2］。由于多數(shù)器官缺乏特異的表面標(biāo)記，腫瘤干細(xì)胞研究的首要問(wèn)題就是分離鑒定。

目前，已有CD分子標(biāo)志物被確定為固體腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。CD133是一種造血干細(xì)胞表面抗原，最近被確定為腦瘤、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤潛在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物［3-4］。CD90(Thy-1)是一種分子量為25～37 KDa的GPI錨定蛋白，其主要由白細(xì)胞表達(dá)，參與細(xì)胞間及細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，它也在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及肝臟干細(xì)胞中表達(dá)［5］。CD44，也被稱(chēng)為歸巢細(xì)胞黏附分子，是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白，這已被確定為乳腺癌和頭頸部癌的干細(xì)胞標(biāo)記物［6-7］。CD24是一種單鏈唾液酸糖蛋白，分子量為42 KDa，而CD34是一種分子量約110 KDa的單核細(xì)胞表面抗原，其選擇性地在人類(lèi)造血祖細(xì)胞中表達(dá)［8］。本研究擬對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中CD133、CD90、CD44、CD34、CD24 這5 種 CD 標(biāo)記物的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2、MHCC-97H、SK-HEP-1細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所保存。PE-CD133、FITC-90、APC-CD44、PE-CD24、PECD34流式抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。FACS Aria流式細(xì)胞儀及分析軟件為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品制備:高、低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株SK-HEP-1、MHCC-97H、HepG2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)，置于37℃恒溫，維持5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，PBS洗3次，胰酶+EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)分別收集約1×106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次，1000 r/min離心 10 min，棄上清。

1.2.2 流式抗體染色:在制備好的細(xì)胞樣品內(nèi)加入5 μL流式抗體及50 μL PBS緩沖液，混勻懸浮細(xì)胞，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，1000 r/min離心10 min，留沉淀?xiàng)壣锨?，加?00 μL PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)流式抗體染色標(biāo)記后分析CD標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:① 在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC-97H、SK-HEP-1細(xì)胞株及低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞株中均無(wú)CD133+CD90+和 CD34的表達(dá)(見(jiàn)圖 1、圖 2);②CD133在低轉(zhuǎn)移潛能的 HepG2細(xì)胞中陽(yáng)性率僅0.1%，在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC-97H和SK-HEP-1細(xì)胞中表達(dá)水平也較低，分別為0.4%和0.1%(見(jiàn)圖1);③CD90在高低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中表達(dá)有明顯差異，在低轉(zhuǎn)移潛能HepG2細(xì)胞中CD90的陽(yáng)性率僅0.05%，而在高轉(zhuǎn)移潛能的 MHCC-97H和SK-HEP-1細(xì)胞中其陽(yáng)性率分別為0.2%和72.0%(P﹤0.05)(見(jiàn)圖3);④ HepG2、MHCC-97H及SK-HEP-1細(xì)胞株中CD44陽(yáng)性率逐漸增加，分別為0.1%、98.2%和99.7%，而 HepG2、MHCC-97H 及 SK-HEP-1細(xì)胞株中CD90+CD44+細(xì)胞比率分別為0.05%、0.2%和72.0%(見(jiàn)圖3);⑤ 在低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株HepG2中CD44+CD24+占0.05%，低于高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株MHCC-97H中的10.3%和 SK-HEP-1細(xì)胞中的 0.3%(P ＜0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133、CD90在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株的表達(dá);圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD34在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株的表達(dá);圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD90在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株的表達(dá);圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD24在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株的表達(dá)Fig 1 Expression of CD133/CD90 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 2 Expression of CD44/CD34 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 3 Expression of CD44/CD90 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 4 Expression of CD44/CD24 in HCC cell lines detected by flow cytometry

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是一類(lèi)特殊的干細(xì)胞，由于其具有自我更新和分化潛能，以及高致瘤性和耐藥性的特點(diǎn)，被認(rèn)為是腫瘤形成及不斷生長(zhǎng)的根源［2］。腫瘤干細(xì)胞通常以干細(xì)胞標(biāo)記物為其特征，特異性分子標(biāo)志物可用于腫瘤干細(xì)胞的鑒定和分選，是研究腫瘤干細(xì)胞必不可少的工具，但目前已確定的特異性標(biāo)志物仍較少。

以往研究表明，CD133抗原是造血干細(xì)胞和神經(jīng)元干細(xì)胞的標(biāo)志，并發(fā)現(xiàn)CD133在人胎肝及肝組織的修復(fù)過(guò)程中有表達(dá)。本研究證實(shí)高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC-97H肝癌細(xì)胞中CD133的表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞。Suetsugu等對(duì)CD133+肝癌細(xì)胞與CD133－細(xì)胞的體外增殖能力及成熟肝細(xì)胞標(biāo)記(谷氨酰胺合成酶、細(xì)胞色素酶P450)表達(dá)情況進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133+肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的體外增殖能力并低表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記物［9］。Yin等使用分離的CD133+SMMC-7721細(xì)胞株所進(jìn)行的成瘤實(shí)驗(yàn)表明，CD133+細(xì)胞與CD133－細(xì)胞相比具有高致瘤性和高集落成瘤能力［10］。但是在人類(lèi)多種腫瘤標(biāo)本中均可分離出CD133+細(xì)胞，目前CD133被認(rèn)為是腦腫瘤干細(xì)胞、直腸癌干細(xì)胞、結(jié)腸癌干細(xì)胞等通用的表型標(biāo)志物［3-4］，由于其并不具有組織特異性，因此，不是一個(gè)特異性較高的肝臟惡性腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。此外，CD34是一種與新生小血管相關(guān)的抗原，主要在血管源性腫瘤及多種腫瘤間質(zhì)的小血管中表達(dá)［8］，但因?yàn)楸狙芯克褂玫氖歉伟┘?xì)胞株，無(wú)新生小血管存在，所以在三種細(xì)胞株中均未見(jiàn)CD34陽(yáng)性表達(dá)。

CD90是一種主要在白細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白，目前發(fā)現(xiàn)其在骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及肝臟干細(xì)胞上也有表達(dá)。CD44作為一種與腫瘤密切相關(guān)的跨膜糖蛋白，其過(guò)量表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。我們的研究表明:CD90和CD44在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)有顯著差異，隨著轉(zhuǎn)移潛能的增加，兩者的表達(dá)呈遞增趨勢(shì);CD90+CD44+細(xì)胞比率分別為 HepG20.05%、MHCC-97H 0.2%和SK-Hep-172.0%;并且CD44+CD24+在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC-97H和SK-HEP-1肝癌細(xì)胞中表達(dá)也高于低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞，這表明CD90+CD44+、CD44+CD24+的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有一定的相關(guān)性。新近研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于肝癌細(xì)胞株的CD90+細(xì)胞具有致瘤能力;來(lái)源于肝癌患者的所有腫瘤組織標(biāo)本及91.6%的血液樣本都具有CD45－CD90+細(xì)胞群，這群細(xì)胞能在免疫缺陷小鼠身上生成腫瘤結(jié)節(jié)。此外，CD90+CD44+細(xì)胞比CD90+CD44－細(xì)胞表現(xiàn)出更具侵襲性的表型，并且前者能在免疫缺陷小鼠的肺部形成侵襲性病灶。同時(shí)，CD44的敲除能阻止CD90+細(xì)胞形成局部或轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)［11］。這提示CD90和CD44是潛在的原發(fā)性肝癌的干細(xì)胞標(biāo)記物，其可提示腫瘤干細(xì)胞的存在。但CD90+CD44+細(xì)胞是否具有自我更新及分化潛能，CD24/CD90/CD44的聯(lián)合標(biāo)記是否有助于提高肝癌干細(xì)胞篩選的特異性，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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