茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟纖維化的保護(hù)作用研究

赫長勝 李源淵 岳洪義 薛 峰 劉 健

1.山東省青島市膠州中心醫(yī)院肝膽外科，山東青島 266300；2.河北省保定市第一人民醫(yī)院兒科，河北保定 071000

茵陳為菊科多年生草本植物濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分，具有清利濕熱、利膽退黃之功效，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療黃疸的主要藥物之一。近年來的研究結(jié)果顯示，茵陳中含有多種有效成分及微量元素[1-2]，其中多糖是其主要組分之一，本文就茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟纖維化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，為中藥茵陳的開發(fā)利用及梗阻性黃疸的臨床資料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

茵陳多糖（本課題組自制），肝臟組織層粘連蛋白（laminin，LA）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HA）、Ⅲ型前膠原（Type Ⅲ pro collagen，PC-Ⅲ）及Ⅳ型膠原（typeⅣ collagen，Ⅳ-C）檢測試劑盒（購自天津原子能公司），放射免疫計(jì)數(shù)器（購自天津原子能公司）。

1.2 動物及分組

Wistar大鼠40只，清潔級，雌雄不拘，3～4周齡，體重80～100 g，由河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可稱號：SCXK（京）2009-0004。20℃左右室溫條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為四組，對照組、模型組、茵陳多糖高劑量組（高劑量組）、茵陳多糖低劑量組（低劑量組），每組10只。

1.3 動物模型的建立與干預(yù)

模型組、高劑量組、低劑量組動物于造模前禁食12 h，禁水4 h，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，常規(guī)消毒腹部皮膚，行上腹正中切口，暴露并游離膽總管，用絲線將膽總管中上段雙重結(jié)扎，而后關(guān)腹；對照組僅暴露并游離膽總管，不結(jié)扎。各組大鼠于術(shù)后當(dāng)天起，分別給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)，高、低劑量干預(yù)組幼鼠鼠分別灌胃茵陳多糖0.8、0.4 mg/kg，每日1次，對照組、模型組大鼠灌胃同體積生理鹽水，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.4 生化指標(biāo)的檢測

術(shù)后2周對相應(yīng)組別的幼鼠以乙醚吸入麻醉后，剪開右頸部暴露頸靜脈，行頸靜脈取血，分離血清，按試劑盒說明書操作規(guī)程測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、直接膽紅素（ndirect bilirubin，DBIL）含量。

1.5 肝組織勻漿制備

幼鼠處死后立即開腹采集肝臟標(biāo)本，制備肝組織勻漿，冰鹽水漂洗、剪碎，制備組織勻漿，勻漿介質(zhì)（蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，EDTA-2Na 0.01 mol/L，Tris-HCL 0.1 mmol/L，0.8%NaCl溶液，蔗糖0.01 mmol/L），組織勻漿后低溫高速離心，上清液待測。

1.6 LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C 的檢測

LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C檢測采用放射免疫法，檢測過程嚴(yán)格按照儀器及試劑使用說明書進(jìn)行。

1.7 肝臟組織病理標(biāo)本制備及觀察

肝臟組織病理標(biāo)本制備采用肝中葉組織，常規(guī)方法固定包埋，4 μm厚度切片，HE染色，100目光鏡觀察拍片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠肝臟組織病理標(biāo)本比較

對照組大鼠肝臟形粉褐色態(tài)飽滿，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，分葉清晰，鏡檢見肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉、匯管區(qū)及肝竇形態(tài)正常，分布均勻（圖1A），模型組大鼠肝臟形態(tài)不規(guī)則，邊緣圓鈍，肝臟黃染，鏡檢可見肝臟小葉點(diǎn)片狀壞死，肝小葉間隙增寬，纖維組織增生，竇間隙及肝竇中炎癥細(xì)胞增多（圖1B）。低劑量組及高劑量組肝臟形態(tài)規(guī)則，肝臟黃染及變形較模型組輕，光鏡檢查可見肝臟小葉壞死少見，肝小葉間隙增寬，纖維組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤較模型組輕（圖 1C、D）。

2.2 茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

造模2周后，模型組、高、低劑量組幼鼠血清AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平升高， 高、 低劑量組 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL水平低于模型組 （P<0.05）， 高劑量組 TBIL、DBIL、IBIL水平低于低劑量組（P<0.05）。見表1。

2.3 茵陳多糖對梗阻性黃疸幼鼠肝組織勻漿中肝纖維化指標(biāo)的影響

造模2周后，模型組大鼠血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度高于對照組，低劑量組及高劑量組血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于模型組（P<0.05），高劑量組血清HA及Ⅳ-C濃度低于低劑量組（P<0.05）。見表2。

3 討論

梗阻性黃疸是臨床的常見疾病，多由于膽道腫瘤、結(jié)石及先天性畸形導(dǎo)致的膽道梗阻引起，膽道梗阻后引起膽汁排泄障礙，膽道壓力增高，繼發(fā)膽汁分泌障礙，伴隨膽道的壓力增高，膽汁逆流入血，引起梗阻性黃疸及肝臟組織結(jié)構(gòu)的損傷及膽色素代謝障礙，膽色素具有細(xì)胞毒性，梗阻性黃疸能夠引起多器官功能及結(jié)構(gòu)的損傷，其中以肝臟結(jié)構(gòu)及功能損傷最為突出，嚴(yán)重者可以引起膽汁性肝纖維化及肝硬化，導(dǎo)致肝臟儲備功能下降，甚至功能衰竭，因此梗阻性黃疸患者肝功能的保護(hù)及防止繼發(fā)性的肝臟纖維化性損傷是梗阻性黃疸患者圍術(shù)期治療關(guān)鍵問題之一。

表1 各組幼鼠血清生化指標(biāo)比較（±s，n=10）

表1 各組幼鼠血清生化指標(biāo)比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

組別 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L） IBIL（μmol/L） DBIL（μmol/L）對照組模型組高劑量組低劑量組83.41±9.67 699.46±72.38*496.34±52.81*#513.46±53.25*#39.98±4.88 269.98±30.78*149.51±16.28*#152.58±16.31*#4.39±0.54 227.46±23.18*87.38±9.38*#109.06±10.87*#■3.71±0.46 97.98±10.03*32.52±3.42*#46.54±4.72*#■3.79±0.47 64.38±6.52*29.78±3.05*#32.28±3.94*#

表2 各組幼鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標(biāo)比較（±s，n=10，ng/mL）

表2 各組幼鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標(biāo)比較（±s，n=10，ng/mL）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

組別 LA HA PC-Ⅲ Ⅳ-C對照組模型組高劑量組低劑量組51.92±6.04 95.46±11.49*70.14±8.06*#77.29±9.13*#714.35±22.16 1 516.42±133.09*1 059.45±106.94*#1 256.42±117.09*#■68.42±9.25 138.46±11.54*80.02±8.79*#86.54±10.26*#29.28±5.14 54.29±6.02*28.50±5.16*#45.06±6.27*#■

茵陳是我國的傳統(tǒng)中藥，具有利膽退黃作用，以茵陳為主要成分的中藥在黃疸的治療中具有獨(dú)特的作用，近年來的藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，在茵陳中含有多種組分，其中多糖是有效的組分之一[3]。研究顯示，茵陳的多糖組分具有抗氧化作用，能夠清除DPPH等氧自由基[4]，減少組織及細(xì)胞的氧化損傷。氧自由基大量生成是梗阻性黃疸肝臟損傷原因之一，茵陳多糖的抗氧化作用可能是其發(fā)揮肝臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。此外，研究表明[5-6]，多糖能降低肝纖維化鼠肝組織的膠原沉積，減少前膠原纖維的表達(dá)，改善肝纖維化，也能夠通過抑制肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的TGF-β表達(dá)和下調(diào)Smad 3的表達(dá)發(fā)揮抗肝臟纖維化作用。

筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，給予茵陳多糖干預(yù)后，高、低劑量組幼鼠 AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL 水平低于模型組，說明茵陳多糖能夠改善梗阻性黃疸大鼠的肝臟損傷，同時(shí)在高低劑量組之間TBIL、IBIL水平表現(xiàn)出明顯的差異，說明茵陳多糖對梗阻性黃疸肝臟損傷的保護(hù)作用具有明顯的量效關(guān)系。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸能夠引起幼鼠的肝臟纖維化，在結(jié)扎膽總管2周后幼鼠的肝臟纖維化指標(biāo)LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C均有不同程度提高，低劑量組及高劑量組血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于模型組，而且在高低劑量組之間也存在顯著差異，說明茵陳多糖能夠減輕梗阻性黃疸引起的肝臟損傷，改善肝臟纖維化。

[1]石玉平，馮瑛，王永寧，等.微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定藏茵陳中的微量元素[J].化學(xué)試劑，2000，33（11）：1019-1020，1044.

[2]胡彥武，關(guān)穎麗，姚慧敏，等.野生綿茵陳和花茵陳中綠原酸含量的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2011，17（9）：78-80.

[3]劉曉河，梁惠花，譚曉紅.茵陳中多糖的含量測定[J].中草藥，2003，34（6）：519-520.

[4]戴喜末，熊子文，羅麗萍.響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究[J].食品科學(xué)，2011，32（8）：93-97.

[5]周程艷，艾凌艷，王美，等.杜仲多糖抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，2011，42（2）：324-329.

[6]施磊，李俊，王佳佳，等.屏風(fēng)多糖對大鼠肝纖維化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（5）：651-654.