VEGF干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在MHCC97L細(xì)胞中的表達(dá)

丁治國 何 蓓 陳曉珩 汪唐順 高 翔 李乃卿

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，與受體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移，加速形成新生血管。研究表明，VEGF及其受體在肝癌癌組織中較正常肝組織呈過表達(dá)，并與肝癌的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療密切相關(guān)[1-3]。因此，VEGF已成為目前腫瘤抗血管治療的熱點(diǎn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)課題組原研藥物參芪扶正注射液可顯著抑制人肝癌細(xì)胞MHCC97L的生長、侵襲能力，并能下調(diào)VEGF基因表達(dá)。為進(jìn)一步明確VEGF基因“沉默”時藥物作用的變化，本研究構(gòu)建了能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生VEGF shRNA的質(zhì)粒，進(jìn)而構(gòu)建并包裝產(chǎn)生高滴度的慢病毒RNAi載體，并實(shí)現(xiàn)其在人肝癌細(xì)胞MHCC97L中表達(dá)，抑制MHCC97L細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究VEGF基因與參芪扶正注射液藥物效果的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Platimum HIFI Taq Polymerase高保真擴(kuò)增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特異性引物、10×PCR Buffer、Mg2+（50 mmol/L）、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L

dNTPs（購自美國Invitrogen公司）；T載體、plenti6.3MIR載體、293細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、ddwater（購自上海諾百生物科技有限公司）；T4 Ligase（購自加拿大NEB公司）；DMEM培養(yǎng)基（購自美國HYCLONE公司）；FBS（購自法國biowest公司）；24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（購自美國Corning公司）；熒光顯微鏡（購自日本Olympus公司），熒光定量PCR儀（購自美國Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建和鑒定 針對人類VEGF基因mRNA序列（NCBI GenBank，基因編號：AF022375），利用 invitrogen 公司BLOCK IT RNAi DESIGNER工具設(shè)計干擾序列如下，200-F：TGCTGTGAAGATGTACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA；200-R：TGCTGTGAAGATG TACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA； Negative-F：TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT；Negative-R：CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC。將 2對 oligo（包括陰性對照鏈）退火成雙鏈。然后連接線性化的plenti6.3-MIR載體，構(gòu)建2個miRNA慢病毒載體質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑選陽性克隆，用載體通用引物進(jìn)行菌落PCR篩選。篩選得到的陽性克隆進(jìn)行測序，以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設(shè)計的oligo序列一致。

1.2.2 RNAi慢病毒的包裝 取對數(shù)生長期細(xì)胞293T細(xì)胞，按照每個10 cm的培養(yǎng)皿6×106個細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)液；取9 μg Packaging Mix和 3 μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒加入 1.5 mL Opti-MEM（經(jīng) 37℃預(yù)熱）中混勻；取 36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中混勻；混合質(zhì)粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min；將3 mL質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中混勻，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS；48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，3 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過濾；將病毒原液在50 000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于200 μL DMEM培養(yǎng)液中，分裝小管，放置于-80℃下備用。

1.2.3 孔稀釋法測定病毒滴度 測定前1 d，對293T細(xì)胞進(jìn)行傳代，96孔板上每孔加入約8 000個細(xì)胞，體積100 μL。將病毒儲存液按梯度稀釋（每50微升中含慢病毒液1×10-3～1×10-8mL），吸去96孔板中原先的培養(yǎng)基，然后在每孔中加入50 μL慢病毒稀釋用培養(yǎng)基，混勻各管慢病毒稀釋液，再各取50 μL慢病毒稀釋液加入到每孔細(xì)胞中，每個稀釋度3個重復(fù)。繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液。5～6 d后觀察熒光表達(dá)，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少，計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細(xì)胞個數(shù)，病毒滴度（TU/mL）=（熒光細(xì)胞個數(shù)×轉(zhuǎn)染時細(xì)胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積）×1/稀釋濃度。

1.2.4 熒光定量PCR檢測VEGF表達(dá) 以MOI值100浸染人肝癌MHCC97L細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞。按Trizol裂解液說明書進(jìn)行細(xì)胞RNA的抽提；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：取 1 μg RNA，用 oligodt18 引物，42℃ 60 min，70℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。VEGF上游引物 5’-ACTGCCATCCAATCGA GACCC-3’，下游引物 5’-TGAGGTTTGATCCGCATAATC-3’。內(nèi)對照β-Actin上游引物5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。按實(shí)時PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系，反應(yīng)置于熒光定量PCR儀中，設(shè)定程序：預(yù)變性 95℃ 120 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，40個循環(huán)；熒光信號實(shí)時檢測。以MHCC97-空白組細(xì)胞為對照，采用 2－△△CT（CT 代表循環(huán)閾值）法計算相對定量。

2 結(jié)果

2.1 oligo連接入plenti6.3-MIR測序DNA

測序結(jié)果證實(shí)oligo已正確連接入plenti6.3-MIR，序列與預(yù)期序列完全一致（圖1）。

圖1 oligo連接plenti6.3-MIR測序（部分）

2.2 RNAi慢病毒的包裝

plenti6.3-MIG-200轉(zhuǎn)染實(shí)驗24 h后，在熒光顯微鏡下（×100）同一視野的熒光和可見光照片對比，可見大部分細(xì)胞發(fā)出熒光（圖2），說明轉(zhuǎn)染成功。

圖2 在熒光顯微鏡下觀察RNAi慢病毒的包裝（×100）

2.3 RNAi慢病毒滴度測定

根據(jù)熒光顯微鏡和普通顯微鏡（×100）下同時觀察plenti6.3-MIG-200病毒感染293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，在加入10-8mL病毒原液的孔中觀察到表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞分別為37、25和 35 個， 則病毒的滴度為：[（37+25+35）TU/3]/1×10-8mL=3.23×109TU/mL。

2.4 熒光定量PCR檢測VEGF表達(dá)

RNAi慢病毒對人肝癌MHCC97L細(xì)胞的浸染率大于90%（圖3），熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：MHCC97-200組RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率達(dá)到72.2%（表1）。

圖3 在熒光顯微鏡下觀察plenti6.3-mir-200浸染48 h后效果

表1 熒光定量PCR檢測RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率

3 討論

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，具有序列特異性的特點(diǎn)，shRNA可被切割為小干擾性RNA（small interfering RNAs，siRNA），大小一般為21～23個核苷酸，以siRNA作為引導(dǎo)序列，與其具有完全互補(bǔ)序列的同源mRNA，具有特異性抑制目的基因表達(dá)的功能，并且新產(chǎn)生的siRNA可形成沉默復(fù)合物，繼續(xù)對mRNA降解，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)[4-5]。由于RNAi技術(shù)抑制目的基因表達(dá)的效果確切，并且具有穿透性高和級聯(lián)式放大效應(yīng)等特點(diǎn)，因而在基因功能研究中具有很好的應(yīng)用前景[6]。

慢病毒載體是一種新的病毒載體系統(tǒng)，是在HIV-Ⅰ病毒的改造基礎(chǔ)上形成的，其能夠高效率地向動物或人的細(xì)胞系中導(dǎo)入目的基因，慢病毒載體具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，其介導(dǎo)的目的基因可完全整合到宿主細(xì)胞的基因組中，發(fā)揮基因表達(dá)或沉默作用持續(xù)并且穩(wěn)定，并且不隨著細(xì)胞的傳代而減弱，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的長期表達(dá)[7]，這一點(diǎn)與目前常見的腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比具有顯著優(yōu)勢。當(dāng)慢病毒載體用于RNAi研究時，不但可以高效抑制目的基因的表達(dá)，同時還可以充分發(fā)揮其作為病毒載體的自身優(yōu)勢，是基因功能研究中的有力工具[8-10]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)課題組的原研藥物——參芪扶正注射液，可顯著抑制人肝癌細(xì)胞MHCC97L的生長、侵襲能力，并能下調(diào)VEGF基因表達(dá)，為進(jìn)一步明確VEGF基因是否是藥物發(fā)揮抑瘤作用的關(guān)鍵，需要在體內(nèi)外實(shí)驗中實(shí)現(xiàn)VEGF基因在人肝癌細(xì)胞MHCC97L中“沉默”，以便在VEGF基因沉默狀態(tài)下進(jìn)一步研究藥物抑瘤作用的變化。本研究成功構(gòu)建了能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生VEGF shRNA的質(zhì)粒，進(jìn)而構(gòu)建并包裝產(chǎn)生高滴度的慢病毒RNAi載體，并有效整合至人肝癌MHCC97L細(xì)胞中，顯著抑制了MHCC97L細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，抑制率達(dá)72.2%，這將為今后從體內(nèi)、體外系統(tǒng)研究VEGF沉默對參芪扶正注射液抑瘤作用變化的影響提供可靠的技術(shù)平臺。

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