貞芪扶正注射液的提取純化工藝研究

張峻穎，付 瑛，黃羅生

貞芪扶正注射液是根據(jù)“扶正培本、扶正驅(qū)邪”的祖國醫(yī)學(xué)理論，以黃芪與女貞子等中藥為原料制成的復(fù)方注射液，具有補氣養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)免疫功能的作用［1-2］。其中黃芪多糖是黃芪中含量最多、免疫活性最強的一類物質(zhì)［3］。大量的研究表明，黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血脂、降血糖、保肝等多種功能［4-5］。女貞子多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及巖藻糖4種糖組成，臨床上常與其他中藥配伍，用于治療腫瘤及改善化療后的白細胞減少等癥狀［6］。本實驗采用4因素3水平正交試驗L9(34)，選擇多糖為綜合考察指標，優(yōu)化貞芪扶正注射液的提取純化工藝，為其進一步開發(fā)、利用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

GW751分光光度計，D-(+)-葡萄糖標準對照品(中國藥品生物制品鑒定所);中空纖維超濾器(10 K，外流型)，北京市旭成超濾設(shè)備廠;BS-100A自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠。

黃芪購自甘肅，經(jīng)鑒定其原植物為蒙古黃芪，女貞子產(chǎn)地浙江，經(jīng)鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計［7-8］按L9(34)表條件對女貞子與黃芪進行多糖的提取和測定，其收率與含量的加權(quán)平均值計入綜合評判，并以其作為考察指標。為了提高統(tǒng)計分析的可靠性，每一個條件下都進行重復(fù)試驗(n=2)，測定結(jié)果取其平均值供統(tǒng)計分析用。因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2 多糖的提取與收率測定 取黃芪和女貞子藥材，粉碎成粗粉，各稱取100 g，按L9(34)組合試驗條件進行提取，合并提取液，濾過;減壓濃縮成每1 mL相當(dāng)于1 g生藥的藥液，加乙醇至含醇量達90%，靜置24 h，濾過;沉淀用95%的乙醇洗滌，揮盡乙醇，取沉淀加適量蒸餾水溶解，再加乙醇至含醇量達80%，靜置24 h，離心濾過。沉淀用無水乙醇洗滌，減壓過濾，低溫干燥，即得多糖粗品，稱重，與取藥材量相比，即得收率。

2.3 5%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾，收集182℃餾分，稱取10 g置棕色瓶內(nèi)，加水溶解并稀釋至200 mL，搖勻，置冰箱中備用。對照品溶液的制備:精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品25 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.4 標準曲線繪制［9］取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液 0、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 共 7份，分別置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。各精密量取2.0 mL，置具塞試管中，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫。于490 nm波長處測定吸收值(A)，以A為縱坐標、葡萄糖對照品量為橫坐標(C)，進行回歸計算，得回歸方程A=4.221C-0.022(r=0.999 1)。

2.5 樣品含量測定 取“2.2”項下所得粗多糖約50 mg，105℃干燥至恒重，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2.0 mL，按“2.4”項下自“再加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法測定吸收值。并依回歸方程計算，得多糖的相對含量。為了與收率在綜合分中占有相同重要地位，將其實際測得值縮小為原值的1/100供統(tǒng)計分析。

2.6 方差分析結(jié)果 見表2。

表2 方差分析表

將正交設(shè)計試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果表明，因素A(提取次數(shù))差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，因素B(提取時間)及C(加水倍數(shù))差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。因此，程度依次為A＞C＞B。各因素的最佳水平可確定為A3B1C1，即加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。

2.7 驗證實驗 按照理論最佳工藝A3B1C1，進行驗證實驗，結(jié)果得率為2.0%，粗多糖含量為28.54%，得率及粗多糖含量較高，認為正交試驗得出的結(jié)果可靠，且工藝穩(wěn)定可行。

2.8 超濾法純化貞芪總多糖 貞芪多糖中分子量在3 000～40 000的多糖是產(chǎn)生有效作用的物質(zhì)［10］。貞芪多糖原液用裝有能切割3 000～40 000分子量中空纖維超濾膜的超濾裝置過濾，除去相對分子量＞4萬的樹膠等大分子物質(zhì)。而影響超濾的主要因素有原液濃度(C)和壓力(P)，采用正交試驗設(shè)計［L4(22)］對其進行優(yōu)化。據(jù)多糖自身特點，濃度選擇0.25 mg/mL(C1)和0.50 mg/mL(C2)，壓力選擇0.15 MPa(P1)和0.20 MPa(P2)，流速為20 mL/min;將膜上液和膜下液分離，膜上液棄去不用，收集膜下液，為相對分子量3 000～40 000餾分，冷凍、干燥，得分離產(chǎn)物，得貞芪總多糖，將多糖的得率和多糖含量作為考察指標，考察超濾效果，結(jié)果見表3。

表3 超濾結(jié)果比較

由表1可見，超濾過程中，在原液濃度0.5 mg/mL、壓力0.2 MPa下結(jié)果最好，其多糖的含量為59.4%。

2.9 貞芪扶正注射液的制備工藝 取上述步驟制備的貞芪總多糖，加適量注射用水使溶解，加等滲調(diào)節(jié)劑適量，用注射用水配成溶液，加入0.1%的針用活性炭，煮沸15～20 min，過濾，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，濾過;100℃流通蒸汽滅菌40 min，即得。

3 討論

中藥活性多糖作為生物免疫調(diào)節(jié)劑，通過提高機體的免疫功能，如增強細胞免疫和體液免疫作用達到抗腫瘤目的。

本研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法制備貞芪多糖，并利用正交試驗篩選最佳工藝條件，該方法簡便易行，資源利用率高，生產(chǎn)成本低。

根據(jù)上述試驗，貞芪多糖的提取純化方案可確定為:藥材加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。合并提取液，濾過;減壓濃縮成每1 mL相當(dāng)于1 g生藥的藥液，加乙醇至含醇量達90%，靜置24 h，濾過;沉淀用95%的乙醇洗滌，取沉淀加適量蒸餾水溶解，再加乙醇至含醇量達80%，靜置24 h，離心濾過。沉淀用無水乙醇洗滌，減壓過濾，低溫干燥，得粗多糖。取0.5 mg/mL粗多糖原液可用裝有能切割3 000～40 000分子量中空纖維超濾膜的超濾裝置過濾，壓力為 0.2 MPa，流速為20 mL/min，將膜上液和膜下液分離，收集膜上液，為相對分子量3 000～40 000餾分，冷凍、干燥，得貞芪總多糖。

為了除去雜質(zhì)并最大限度保留有效成分，傳統(tǒng)的提取純化工藝經(jīng)常采用在濃縮的水提液中，加入適量乙醇以除去其中的淀粉、小分子糖、單糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

本研究采用膜分離技術(shù)代替了醇沉工藝，僅在膜分離之前采用醇沉作為前處理步驟。膜分離技術(shù)是一項新興的高效分離技術(shù)，被公認為是20世紀末到21世紀中期最有發(fā)展前途的重大高新生產(chǎn)技術(shù)之一，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)保等多個領(lǐng)域［11］。在中藥制藥企業(yè)中，主要用于去除藥液中大量的鞣質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)等非藥用大分子物質(zhì)，增加藥品的澄明度和制劑質(zhì)量。從本試驗結(jié)果可以看出，使用超濾法分離多糖切實可行，且具有操作簡單、節(jié)能、無污染、可在常溫下連續(xù)操作等優(yōu)點。但前提條件是，必須知道所要分離的多糖的相對分子量，這樣才能有效地選取中空纖維超濾柱截留值，否則必須通過預(yù)選才能確定截留值。另外，超濾時壓力不易過大，過大會影響膜的壽命。

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