比較卡鉑對乳腺癌細胞及血小板生成素作用下巨核細胞的影響

李自健，楊俊蘭，焦順昌，張 帆，謝文秀，游俊浩

1解放軍第161醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，湖北武漢 430012；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3海軍總醫(yī)院特需醫(yī)療部，北京 100037

惡性腫瘤患者化療后常導致不同程度的血小板減少，以往臨床多采用輸血小板，目前臨床常在化療后使用血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)來治療[1-8]，但起效較慢[7]。國外有研究在化療前使用血小板生成素[9]，但目前臨床上對此有些擔心，是否會加重化療藥物對巨核細胞的抑制以及是否安全。本實驗通過觀察化療藥物卡鉑對乳腺癌細胞和使用TPO的巨核細胞的抑制率比較，模擬臨床上化療前使用TPO化療藥物對巨核細胞和腫瘤細胞的影響，間接了解化療前使用TPO是否安全。

材料和方法

1 主要材料 TPO(沈陽三生1ml：15 000U)，卡鉑注射液(齊魯公司10ml：100mg)，天津血研所提供的巨核細胞株MO7e細胞、解放軍總醫(yī)院腫瘤實驗室提供的人乳腺癌細胞系MDA-MB-453。

2 細胞培養(yǎng) 把MO7e細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和濃度20ng/ml的TPO)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人乳腺癌細胞系MDA-MB-453培養(yǎng)在RPMI-1640中(含10%胎牛血清)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 TPO不同濃度對MO7e細胞的影響 取MO7e細胞，把細胞濃度調(diào)為2×105/ml，把細胞分10組，每組5個復孔，接種在96孔板中，濃度為每孔2×104/100μl，分別加入0、4、8、16、32、64、128、256、512μg/L濃度的TPO，相同方法重復接種3個96孔板，各培養(yǎng)24h、48h、72h，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算MO7e細胞增殖率。公式=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%，作出增殖曲線，以上實驗全部重復3次。

4 卡鉑對加入TPO的MO7e細胞的抑制率 取MO7e細胞，洗滌2次，懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和256ng/ml的TPO)，細胞濃度調(diào)為2×105/ml。把細胞分成9組，每組6個復孔，濃度為2×104/100μl/孔接種在96孔板中，分別加入0到2 000μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復接種2個96孔板，各培養(yǎng)24h和48h后，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl的DMSO，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算抑制率。公式=1-(實驗組A/對照組A)，作出卡鉑對MO7e細胞作用曲線，以上實驗全部重復3次。

5 卡鉑對乳腺癌細胞系的抑制率 取乳腺癌細胞，細胞濃度為1.5×105/ml，分成7組，每組設(shè)6個復孔，濃度為1.5×104/100μl/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后，1-7組分別加入0到800μg/ml濃度的卡鉑，相同方法重復接種2個96孔板，各培養(yǎng)24和48h后，每孔加入MTT 20μl，4h后棄上清，每孔加入150μl的DMSO，使用酶標儀于492nm波長處測定吸光度值(A)，計算抑制率。作出卡鉑對乳腺癌細胞作用曲線，以上全部實驗重復3次。

6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用-x±s表示，用SPSS17.0軟件統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，相關(guān)性檢驗使用秩和相關(guān)檢驗，多組間比較使用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 TPO濃度變化對MO7e細胞的影響 MO7e細胞增殖率隨TPO濃度增大而增大，TPO濃度達到256ng/ml時，細胞的增殖率達到最大，同時也達到平臺期，濃度達到512ng/ml時細胞增殖率不再增大，取256ng/ml為TPO實驗濃度。見圖1。

2 卡鉑對MO7e細胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對MO7e細胞的抑制率也增加，呈正相關(guān)。各實驗組的抑制率與對照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，同時作圖求得卡鉑對MO7e細胞的IC50，作用24h后IC50=4 000μg/ml，作用48h后IC50=1 600μg/ml，見表1、圖2。

3 卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率 隨著卡鉑濃度增大，對乳腺癌細胞的抑制率也增大，呈正相關(guān)。各實驗組的抑制率與對照組(卡鉑濃度為0μg/ml)相比P<0.01，作圖求得卡鉑對乳腺癌細胞的IC50，作用 24h后 IC50=400μg/ml，作用 48h后IC50=120μg/ml，見表2、圖3。

4 卡鉑對MO7e細胞和乳腺癌細胞的抑制率比較卡鉑對乳腺癌細胞的IC50遠遠小于對MO7e細胞的IC50，差異達10倍左右，表明卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率遠遠大于對MO7e細胞的抑制率，見表3。

表1 卡鉑作用24h和48h對MO7e細胞抑制率變化Tab 1 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

表2 卡鉑作用24h和48h對乳腺癌細胞抑制率變化Tab 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDAMB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

表3 卡鉑對MO7e細胞和乳腺癌細胞的IC50比較Tab 3 Effect of CBP on IC50 of MO7e cells and MDA-MB-453 cells(μg/ml)

圖1 加入TPO 不同時間細胞增殖率的變化Fig 1 Effect of TPO on proliferation rate of MO7e cells at different time points

圖2 卡鉑作用24h和48h對MO7e細胞抑制率變化Fig 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation rate of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

圖3 卡鉑作用24h和48h對乳腺癌細胞抑制率變化Fig 3 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDA-MB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

討 論

本實驗用MO7e巨核細胞株替代巨核細胞，MO7e細胞能表達血小板特異性的表面標志物，其表面有TPO受體c-Mpl，并且其生長需TPO支持。人類骨髓中巨核細胞數(shù)量非常少，通過實驗方法分離和純化比較困難，并且不易在體外長期培養(yǎng)，因此MO7e細胞株替代巨核細胞，目前是最佳研究TPO對巨核細胞影響的替代細胞[10]。

本實驗觀察到TPO能促進巨核細胞增殖，呈濃度依賴性，TPO濃度256ng/ml時達到平臺期。通過卡鉑對乳腺癌細胞以及對加入TPO的巨核細胞IC50比較，卡鉑對乳腺癌細胞的抑制率遠遠大于對加入TPO巨核細胞的抑制率，提示化療前使用TPO可能是比較安全的。因本實驗是體外實驗，與體內(nèi)實驗尚有一定差距，還需進一步臨床實驗。

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