早孕期完整胚胎切片的制備方法

喬江麗，趙恩鋒，彭紅梅，宋 欣，陳 薇，鄧晉芳，田 俠

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1婦產(chǎn)科；2病理科

人類生殖器官和生殖細(xì)胞起源、發(fā)育的機(jī)制研究一直是生命科學(xué)中重要的研究課題。隨著國(guó)內(nèi)外輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展與應(yīng)用，越來(lái)越多有關(guān)人類胚胎生殖系統(tǒng)發(fā)育方面的研究探索相繼開展。由于人胚的研究受到倫理、道德、宗教等諸多方面的制約，研究相對(duì)緩慢。20世紀(jì)后期美國(guó)學(xué)者M(jìn)oore等[1]在研究人胚胎早期發(fā)育方面(從受精卵到胚胎形成及各系統(tǒng)的早期發(fā)育過(guò)程)取得了很大進(jìn)展。丹麥學(xué)者M(jìn)ollgard等[2]在探索生殖系統(tǒng)發(fā)育的祖細(xì)胞(即生殖細(xì)胞)的遷移等方面也取得初步進(jìn)展。研究胚胎生殖系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程依賴基本的病理技術(shù)操作，目前人類早期胚胎完整切片的制作方法及切片的鏡下特征等在國(guó)內(nèi)外研究領(lǐng)域還是空白，生殖脊早期發(fā)育階段的形態(tài)特征還沒有報(bào)道。我們制作早期胚胎切片，目的是為今后研究人類生殖脊的起源、早期階段的形態(tài)特征和生殖細(xì)胞的起源、遷移等提供技術(shù)支持?，F(xiàn)將人類早期胚胎完整切片的制備過(guò)程報(bào)告如下。

材料和方法

1 胚胎的收集 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得孕婦同意，經(jīng)簽署知情同意書。收集胎齡約為21-35d藥物流產(chǎn)胚胎。所用藥物對(duì)胚胎組織標(biāo)本的制作無(wú)影響，且所用藥物流產(chǎn)胚胎均為已經(jīng)死亡的胚胎。所選早孕婦女均經(jīng)B超檢查確認(rèn)為正常宮內(nèi)早孕且尿妊娠陽(yáng)性。胚胎齡的計(jì)算方法：選擇平素月經(jīng)規(guī)律、周期為28-30d的早孕孕婦，按孕婦末次月經(jīng)日減去14d，并結(jié)合胚胎發(fā)育的外部特征計(jì)算胎齡。

2 取材與固定 所有藥物流產(chǎn)的完整胚胎直接用4%甲醛固定。將胎囊在解剖顯微鏡下解剖，找到胎芽及卵黃囊，除去多余絨毛膜囊，取出完整胎芽及卵黃囊，濾紙包裹標(biāo)記好方向及體位。進(jìn)行常規(guī)脫水 (經(jīng) 50%，70%，80%，90%，100%等梯度乙醇脫水)，二甲苯浸透，浸蠟(置于56-60℃熔化的石蠟中2-3h，使石蠟充分滲透組織內(nèi)部)，液體石蠟包埋，切片與HE染色等步驟。光鏡下觀察人類早期胚胎形態(tài)結(jié)構(gòu)特征并照相。

結(jié) 果

1 切片制備情況 藥流囊胚55例采用此方法制備胚胎完整切片，成功30例(成功率為55%)。剩余制備失敗的25例中有17例胎囊中未見到胎芽，8例由于胎芽過(guò)小過(guò)嫩，在進(jìn)行夾取固定或石蠟包埋時(shí)組織遭到損壞，以至鏡下觀察時(shí)結(jié)構(gòu)不典型，難以辨認(rèn)。

2 大體標(biāo)本 顯微鏡下大體標(biāo)本可見完整胚胎及卵黃囊，胚胎呈新月狀，凹面為腹側(cè)，凸面為背側(cè)。腹側(cè)從上至下依次為頭部，心臟等結(jié)構(gòu)；側(cè)面可見胚胎上肢芽和下肢芽；背側(cè)清晰可見脊柱成串排列。胚胎下方為圓形近透明的卵黃囊。見圖1。

3 HE染色鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu) 切片干凈，完整，能清楚辨認(rèn)出胎兒頭部、心臟、肝臟等器官，脊柱成串排列，其他內(nèi)臟器官如腎臟、生殖器官等(泌尿生殖嵴等還未開始發(fā)育)還未生成；卵黃囊呈不規(guī)則圓形。見圖2。

圖1 30d人胚胎鏡下大體標(biāo)本(×12)藍(lán)色箭頭指示卵黃囊，紅色箭頭指示胎兒頭部，藍(lán)色三角指示心臟，紅色三角分別指示上下肢芽，黑色箭頭指示脊椎。圖2 30d人胚胎石蠟切片HE染色鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)(×13)藍(lán)色箭頭指示卵黃囊，紅色箭頭指示頭部，紅色三角指示心臟區(qū)，黑色箭頭指示脊椎。Fig 1 Gross human embryo on day 30 of fertilization(original magnification ×12)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, blue triangle indicates heart, red triangle indicates anterior limb bud and posterior limb bud, black triangle indicates vertebral column.Fig 2 Morphology of embyo on day 30 of fertilization after HE staining(original magnification ×13)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, red triangle indicates heart, black triangle indicates vertebral column.

討 論

有關(guān)人類早期胚胎的認(rèn)識(shí)及各階段形態(tài)特征的研究國(guó)外學(xué)者研究的較早，并取得了很大的成果[2]。在人類早孕期胚胎完整切片的制備方面有其獨(dú)特的方法，他們把胎齡為28-56d大小的人胚胎行磁共振成像攝片[3]，對(duì)人類早期胚胎生殖系統(tǒng)及內(nèi)外生殖器官發(fā)育進(jìn)程也有研究[4]。而國(guó)內(nèi)目前主要集中于對(duì)鼠胚的研究，2003年有小鼠早期胚胎細(xì)胞切片制備的報(bào)道[5]，2004年劉曉蓉等報(bào)道采用石蠟切片完成對(duì)鼠胚生殖腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察研究[6]，2005年劉淑琴等報(bào)道制備出鼠胚不同階段的完整切片[7]，2009年制備出含中腎旁管的小鼠胚胎組織石蠟切片[8]。有關(guān)人早期胚胎的完整切片制備基本上還是一片空白，無(wú)相關(guān)報(bào)道。在用石蠟包埋制備完整人胚蠟塊的方法成功應(yīng)用之前，我們也曾試過(guò)用瓊脂糖固定胚胎[9]，試圖精修后做石蠟切片，但是由于瓊脂糖的透明度及軟硬度不能達(dá)到滿意效果，不得不繼續(xù)尋找其他可行方法。

經(jīng)過(guò)對(duì)此方法反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究，得出在進(jìn)行人類早期胚胎切片的制備過(guò)程中需注意以下操作：1)要借助光源找到絨毛膜囊內(nèi)的胎芽和卵黃囊，沒有光源很容易將其與絨毛組織混淆，甚至無(wú)法辨認(rèn)；2)早孕期胎芽較小較嫩，操作必須非常輕柔仔細(xì)，否則極易將卵黃囊和胎芽破壞，失去其完整性；3)在用濾紙包裹固定時(shí)，不能直接夾取胎芽或卵黃囊，最好留一小部分絨毛膜囊便于操作；4)浸蠟后的包埋操作同樣要輕柔、仔細(xì)，認(rèn)真辨認(rèn)，避免直接夾取胎芽和卵黃囊組織?？傊麄€(gè)過(guò)程一定要非常輕柔、仔細(xì)，才可能確保胎芽和卵黃囊的完整性，也才可能得到完整的切片。切片制作成功率不是很高，一方面由于胚胎本身發(fā)育障礙所致只有空胎囊而沒有胎芽發(fā)育；另一方面由于早孕期胎芽組織極其脆嫩，給操作帶來(lái)很大不便，需要熟練的操作技術(shù)；另外操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)影響胚胎組織的質(zhì)量。

人類胚胎石蠟標(biāo)本的制備，解決了標(biāo)本保存的時(shí)間問題，可多次切片，簡(jiǎn)單易行，對(duì)研究人類胚胎發(fā)育和輔助生殖技術(shù)都有重要意義。在今后的研究工作中，我們會(huì)不斷改良方法，制備出更好的人類胚胎發(fā)育各個(gè)階段的完整切片，以便觀察生殖器官的發(fā)育情況及形態(tài)變化特征。

致謝：婦產(chǎn)科趙玉梅、宋東芳、孫繼榮等醫(yī)學(xué)同仁，為我們的工作提供了很大的幫助和支持，在此向她們表示感謝！

1 Moore KL，Persaud TVN. Before we are born ：essentials of embryology and birth defects［M］. 4th. Philadelphia：Saunders，1993：26-299.

2 Mollgard K，Jespersen A，Lutterodt MC，et al. Human primordial germ cells migrate along nerve fibers and Schwann cells from the dorsal hind gut mesentery to the gonadal ridge［J］. Molecular Human Reproduction，2010，16（9）：621-631.

3 Matsuda Y，Ono S，Otake Y，et al. Imaging of a large collection of human embryo using a super-parallel MR microscope［J］. Magn Reson Med Sci，2007，6（3）：139-146.

4 Sajjad Y. Development of the genital ducts and external genitalia in the early human embryo［J］. Obstet Gynaecol Res，2010，36（5）：929-937.

5 呂廣艷，曲淑賢，申 健，等. 小鼠早期胚胎細(xì)胞超薄切片制備法［J］. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（1）：63-64.

6 劉小蓉，安靚，李進(jìn). 昆明胚鼠生殖腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（4）：414-418.

7 劉淑琴，秦建民，曾錦章，等. 不同時(shí)期小鼠胚胎整體石蠟標(biāo)本的制備技術(shù)［J］. 解剖學(xué)雜志，2005，28（6）：721-723.

8 梁琳琳，朱桂金. 含有中腎旁管的小鼠胚胎組織石蠟切片制備［J］. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26（1）：1-3.

9 屈平平，田文儒，高善頌，等. 小鼠附植前胚胎超薄切片的瓊脂糖預(yù)包埋制備方法［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（3）：254-256.