慢性萎縮性胃炎的動物模型研究

馮秀雪，令狐恩強

解放軍總醫(yī)院 消化科，北京 100853

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一種常見的胃部疾病，因與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，尤其是胃竇萎縮性胃炎與腸型胃癌關(guān)系較為肯定，故實驗性萎縮性胃炎的研究成為慢性萎縮性胃炎研究的重要課題。盡管國內(nèi)外建立萎縮性胃炎動物模型的方法很多[1-12]，但建模周期報道不一致[1-10]，而且多利用高濃度乙醇進行建模[6-7]，易造成脂肪肝，對于部分萎縮性胃炎的干預(yù)研究有一定影響。本研究立足小劑量、短周期、低濃度乙醇應(yīng)用結(jié)合其他化學(xué)藥物聯(lián)合刺激胃黏膜，建立萎縮性胃炎模型。

材料和方法

1 動物及分組 健康18-20周Wistar大鼠30只(由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供)，體質(zhì)量200-250g，雌雄各半。實驗前隨機抽取分為兩組，正常組10只，模型組20只。

2 實驗方法 模型組：第1-10周用2%水楊酸鈉和30%酒精混合溶液進行灌胃，第11-22周用20mmol/L去氧膽酸鈉溶液(每天現(xiàn)配)灌胃；按1ml/100g的標準灌胃，1次/d。自由飲用0.1%氨水22周。正常組：正常飲用水按1ml/100g的標準灌胃22周，1次/d。自由飲用正常水22周。

3 觀察指標 1)一般情況：動物精神狀態(tài)，活動情況，毛發(fā)光澤度、食欲、大便及體重等；2)胃標本大體觀察：造模22周后，用體積分數(shù)2%戊巴比妥鈉，45mg/kg麻醉大鼠，剖腹取全胃，沿其大彎剪開作大體觀察，包括胃的大小，胃壁厚度及彈性，黏膜色澤，皺襞多少，是否有出血等。3)胃標本病理學(xué)：將標本固定后分別沿胃前壁、胃后壁縱形取材，沿幽門口橫向取材，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察以下指標：1)萎縮程度：參照全國慢性胃炎共識意見[13]，將萎縮程度分別記為以下分值：0分：固有腺體大致正常；1分：固有腺體數(shù)減少不超過原有腺體的1/3，大部分腺體仍保留；2分：固有腺體數(shù)減少超過1/3，但未超過2/3，殘存腺體不規(guī)則分布；3分：固有腺體數(shù)減少超過2/3，僅殘留少數(shù)腺體，甚至完全消失。2)炎癥情況：在低倍鏡下觀察整個胃黏膜，每只大鼠標本分別觀察胃體、胃竇10個視野，參照1994年美國休斯頓提出的胃炎分級標準[14]，按炎性細胞浸潤程度由輕到重分為0-3級，分別記為0、1、2、3分，取均值代表胃體和胃竇部的炎癥級別：0分：無炎癥；1分：在胃黏膜上皮內(nèi)或固有腺底部可見多個慢性炎性細胞浸潤；2分：在胃黏膜上皮至黏膜肌層均有較多炎性細胞浸潤；3分：胃黏膜內(nèi)可見成堆炎性細胞聚集灶。3)胃黏膜層厚度、黏膜肌層厚度及兩者比值：借助顯微鏡下測微器，在每只大鼠胃病理切片的竇、體部分別觀察5個視野，計算平均值。4)其他胃標本病理觀察：腸化生，胃黏膜上皮細胞細胞核多形性，有無腺體不典型增生等異常表現(xiàn)。5)肝臟病理學(xué)：在麻醉處死大鼠并取出胃標本后，取出肝臟，將左外葉、左中葉、右葉分別固定后沿長軸取材各1塊，石蠟包埋，HE染色，分別觀察肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細胞脂肪變等異常變化。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以-x±s表示，定量數(shù)據(jù)兩組間比較應(yīng)用t檢驗，應(yīng)用CHISS軟件進行統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1 一般情況 兩組各有1只大鼠因灌胃死亡。正常組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動，被毛密而有光澤，大便無異常；模型組大鼠萎縮不振，少動，被毛泛黃而無光澤，飲食較正常組減少，4只出現(xiàn)腹瀉，1只于灌胃4周后出現(xiàn)極度消瘦，處死檢查發(fā)現(xiàn)有腸脹氣現(xiàn)象，肺無異常。兩組大鼠體重變化如圖1所示，造模結(jié)束后正常組大鼠平均體質(zhì)量為(479.5±125.6)g，模型組大鼠平均體質(zhì)量為(370.8±93.0)g，兩組比較P<0.05。

2 胃大體觀察 正常組大鼠胃小，全層胃壁較厚，彈性較好，黏膜呈淺紅色，胃收縮明顯，表面皺襞明顯，光滑且平整，有較多黏液，無出血；模型組大鼠胃多有擴張，胃壁變薄，彈性較差，黏膜顏色呈淺灰色，表面附有疏松的苔狀物，表面皺襞變平或消失，黏液較少，部分可見散在出血點。

3 胃病理學(xué)觀察 正常組鏡下所見胃黏膜上皮完整，表面可見黏液附著，腺體連續(xù)排列，形狀規(guī)則，黏膜層可見散在的少量淋巴及中性粒細胞，黏膜層平滑肌呈環(huán)形排列，未見向黏膜層插入的現(xiàn)象。模型組鏡下可見部分胃黏膜上皮壞死脫落，表面所附黏液較少，腺體排列不規(guī)則，數(shù)量減少，有的呈囊狀擴張；模型組胃竇的萎縮程度評分要高于正常組(P<0.01)，但胃體萎縮不明顯(P>0.05)；黏膜下層及黏膜層均可見炎性細胞浸潤，包括中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞等，并可見炎性細胞成堆現(xiàn)象，模型組炎細胞浸潤程度分值要高于正常組(P<0.01)；模型組可見黏膜肌層增生增厚及部分黏膜肌層向黏膜固有層內(nèi)伸展，呈分支狀插入腺體間，大鼠胃體的黏膜層厚度、黏膜肌層厚度及兩者的比值在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但胃竇部差異顯著(P<0.01)；兩組均未見到腸化生及不典型增生等現(xiàn)象。見表1，圖2，圖3。

4 肝臟病理學(xué)觀察 兩組動物肝臟顯微鏡下觀察肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞無明顯變性，匯管區(qū)血管、血竇及小葉中央靜脈等均無明顯擴張、充血及淤血等情況，見圖4。

表1 兩組間觀察指標比較Tab 1 Indicators observed in two groups(-x±s)

圖1 兩組大鼠平均體重增加曲線圖Fig 1 Mean body weight curves for rats in two groups

圖2 胃體病理圖片(HE)A：正常組胃壁全層結(jié)構(gòu)(×40)；B：模型組中黏膜肌層向固有層內(nèi)伸展(×40)；C：模型組中胃黏膜炎細胞浸潤及出血(×100)；D：模型組中胃腺體囊樣擴張(×100)Fig 2 Pathology of gastric body(HE)A: The whole layer structure in normal group(×40); B: Extension of muscular layer of mucosa into lamina propria of model group(×40);C: Congestion and inflammatory cell infiltration of gastric mucosa in model group(×100); D: Cystic expansion of gastric gland in model group(×100)

圖3 胃竇病理圖片(HE)A: 正常組胃黏膜結(jié)構(gòu)(×100)；B: 模型組胃黏膜可見腺體減少，排列不規(guī)則，炎細胞浸潤明顯(×100)Fig 3 Pathology of gastric antrum(HE)A: Gastric mucosa in normal group(×100); B: Gastric mucosa in model group with less irregular glands and more inflammatory cells(×100)

圖4 模型組大鼠的肝臟病理圖片(HE)A：22周建模結(jié)束后正常肝臟結(jié)構(gòu)(×100)；B：建模10周后可見肝細胞脂肪變，匯管區(qū)血管及血竇充血(×100)Fig 4 Pathology of liver in model group (HE)A: Normal structure after 22 weeks(×100); B: Adipose degeneration and congestion 10 weeks after model establishment(×100)

討 論

慢性萎縮性胃炎的病因尚未完全闡明，目前公認的因素是綜合性的，如HP感染、酗酒、膽汁反流、長期服用非甾體類抗炎藥、重鹽飲食及免疫因素等[1-8]。因慢性萎縮性胃炎病因的復(fù)雜性以及與胃癌發(fā)生的相關(guān)性，建立萎縮性胃炎動物模型，對其診治研究具有重要意義。

在本實驗中用水楊酸鈉模擬長期服用非甾體類抗炎藥的患者，水楊酸鈉可以直接刺激胃黏膜引起炎性反應(yīng)，并能抑制前列腺素合成，而前列腺素具有胃黏膜保護作用[7]，因此用小劑量長時間給藥可損傷胃黏膜并引起慢性炎癥；用酒精模擬酗酒對胃黏膜的損害[4]，酒精對胃黏膜具有刺激作用，能影響胃黏膜的屏障與組織變化；用體積分數(shù)為0.1%的氨水模擬HP感染狀態(tài)下高氨對胃黏膜的毒性損害[6]，以脫氧膽酸鈉模擬膽汁反流損傷胃黏膜作用[6]。通過上述因素綜合作用，建模22周后成功建立萎縮性胃炎模型，并在預(yù)實驗研究中發(fā)現(xiàn)，停用刺激后觀察8周，大鼠萎縮程度無明顯改善。與姒健敏等報道一致[6-7]，本實驗?zāi)Ｐ鸵晕父]萎縮明顯，但胃體部萎縮不明顯，這可能由于胃體萎縮主要與免疫機制有關(guān)。另外，這種建模方法未見腸化生及不典型增生等情況，可能由于刺激時間短，或刺激物在胃內(nèi)停留時間過短(大鼠胃排空時間短，平均2h)有關(guān)[7]，所以這種模型可進一步應(yīng)用于萎縮性胃炎進展性研究中。

酒精對于肝臟的損傷與酒精的攝入量、攝入速度及時間、營養(yǎng)狀態(tài)等因素有關(guān)[15-16]，高濃度酒精或高劑量攝入會引起重度脂肪肝甚至肝硬化[15,17]，在我們預(yù)實驗研究中我們應(yīng)用低濃度酒精、低劑量、短時間灌胃的方法，30%酒精灌胃10周后出現(xiàn)肝細胞脂肪變，匯管區(qū)血管、血竇及小葉中央靜脈擴張充血，但未出現(xiàn)壞死及纖維化，與Tirapelli等[18]報道一致，但停用酒精12周后觀察肝臟脂肪變不明顯，血管充血也明顯減輕。故大鼠肝臟對酒精較敏感，但既往應(yīng)用高濃度酒精(60%)建立萎縮性胃炎模型的研究缺乏對于肝臟的評估[4,6-7]，由于在部分萎縮性胃炎的模型應(yīng)用研究中，肝臟損傷可能影響實驗結(jié)果，所以在模型建立中應(yīng)注意酒精的濃度與應(yīng)用時間及劑量。

綜上所述，綜合應(yīng)用30%酒精、2%水楊酸鈉，20mmol/L的脫氧膽酸鈉及0.1%氨水，22周后成功建立了萎縮性胃炎模型，此模型建立方法簡單，無需特殊設(shè)備和條件，而且對于肝臟病理影響較少，可用于萎縮性胃炎動物模型的應(yīng)用研究。

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