熱灼聯(lián)合液氮冷凍建立兔中晚期股骨頭缺血性壞死動物模型

李富強，寧亞功，張恩龍，徐文漭，李峻輝

1解放軍總醫(yī)院/軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京 100853；2成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院，昆明 650032

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)是臨床常見的高度致殘性疾病。該病病因不明，目前臨床多以原發(fā)性和繼發(fā)性[1]進(jìn)行大致區(qū)分。建立理想的股骨頭壞死動物模型，是進(jìn)行股骨頭壞死治療研究的基礎(chǔ)[2]。目前常用的激素型、乙醇型、液氮冷凍、微波滅活、截骨融合等模型的建立，與臨床ANFH的病因和病理過程仍有很大差異。本實驗在借鑒既往成功經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，旨在探討中晚期(FicatⅢ-Ⅳ期)兔ANFH動物模型的建立，縮短造模時間，為中晚期ANFH的治療研究提供一種合適的動物模型。

材料和方法

1 實驗動物 5月齡日本大耳白兔20只，雌雄不限，體質(zhì)量2.7-3.0kg，由昆明醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。許可證號：SYXK(滇)2005-0008。實驗過程中對動物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[3]。

2 藥品與儀器 戊巴比妥鈉，購自上海艾研生物科技有限公司；液氮，由昆明總醫(yī)院供氧中心提供；可控溫電烙鐵，由昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科改制；雙能X線骨密度檢測儀，購自法國Medllink Osteocore3；核磁共振掃描儀，購自德國Siemens Verio 3.0T。

3 造模方法 取20只兔，左后肢用于造模，右側(cè)對照。戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后，以大轉(zhuǎn)子體表標(biāo)記點為中心，直徑5cm備皮，取右側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒術(shù)野、鋪洞巾，仍以大轉(zhuǎn)子為中心在髖關(guān)節(jié)外側(cè)沿股骨方向作長約3cm切口，于肌間隙逐層切開直達(dá)關(guān)節(jié)囊，環(huán)股骨頸切開關(guān)節(jié)囊，牽引股骨并內(nèi)收暴露股骨頭，顯露股骨頭負(fù)重區(qū)，注意保護(hù)股骨頭韌帶，防止髖關(guān)節(jié)脫位，預(yù)熱電烙鐵，當(dāng)溫度達(dá)100℃時電源自動斷開，將烙鐵頭置于股骨頭負(fù)重面持續(xù)2min，操作中注意保護(hù)周圍組織，而后以液氮棉簽連續(xù)快速冷凍股骨頭25次，10s/次。自然復(fù)溫后用0.9%氯化鈉溶液清洗，逐層縫合術(shù)口。手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后3d術(shù)口周圍肌肉注射青霉素80萬U/d，預(yù)防感染。4 觀察指標(biāo) 1)一般情況：動物的精神狀態(tài)、術(shù)口愈合情況、進(jìn)食、排泄及造模側(cè)肢體活動情況。2)X線、MRI：手術(shù)后觀察髖關(guān)節(jié)、股骨頭形態(tài)，骨密度及骨小梁變化，了解股骨頭壞死情況。3)股骨頭標(biāo)本大體觀察：關(guān)節(jié)囊變化，股骨頭外形、顏色，關(guān)節(jié)面等情況。4)組織病理學(xué)觀察：股骨標(biāo)本放入4%甲醛溶液中固定，取出標(biāo)本自來水沖洗3遍，放入10%硝酸水溶液中脫鈣4-6h，直至針刺入組織無阻力感為止；乙醇梯度脫水后置于二甲苯中透明，標(biāo)本浸蠟，包埋于蠟塊。切片行HE(蘇木素-伊紅)染色。

結(jié) 果

1 一般情況 術(shù)后3d始所有實驗動物精神恢復(fù)，進(jìn)食、排泄正常，術(shù)口5d左右完全愈合，未發(fā)生髖關(guān)節(jié)脫位。術(shù)后4周左右大部分動物出現(xiàn)患肢活動受限，麻醉后被動活動患肢可感覺外展、后伸不同程度受限。

2 X線檢查 造模1周后造模側(cè)股骨頭外形圓，骨密度無明顯變化，骨小梁結(jié)構(gòu)正常；2周時股骨頭外形圓，骨密度稍增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，髖關(guān)節(jié)間隙模糊；4周時股骨頭輕度變扁，表面欠光滑，有囊性結(jié)構(gòu)形成，出現(xiàn)硬化帶，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂；6周時股骨頭外形變扁，表面毛糙，骨密度明顯增加，局部有輕度塌陷征象；8周時髖關(guān)節(jié)周圍發(fā)生增生，股骨頭變小，關(guān)節(jié)面塌陷。見圖1。3 MRI檢查 術(shù)后1周未見明顯信號異常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)少量積液；術(shù)后2周可見壞死區(qū)在T1WI上為中低信號，在T2WI上呈較高信號，周圍環(huán)繞線樣低信號，毗鄰區(qū)域可見骨髓水腫；4周為低信號圍繞的信號不均壞死區(qū)，呈散在、點狀分布于股骨頭內(nèi)；6周時股骨頭脂肪高信號中出現(xiàn)不同形態(tài)的低信號區(qū)，呈環(huán)形、帶狀和灶狀；8周時表現(xiàn)為骨性關(guān)節(jié)炎改變，間隙變窄，關(guān)節(jié)面骨質(zhì)增生，邊緣骨贅形成。見圖2。

4 大體觀察 造模1周后實驗側(cè)股骨頭承重面失去了正常的淡粉紫色，呈灰白色改變，與正常組織之間有明顯界限；2周后股骨頭灰白色面積縮小，與正常組織之間界限模糊，關(guān)節(jié)面尚光滑；4周時股骨頭稍變扁，關(guān)節(jié)軟骨表面毛糙，部分出現(xiàn)剝脫；6周時股骨頭明顯變扁，關(guān)節(jié)軟骨剝脫嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面塌陷；8周時關(guān)節(jié)面進(jìn)一步塌陷，股骨頭變小，環(huán)塌陷區(qū)出現(xiàn)了明顯的增生組織。見圖3。

5 組織病理學(xué)觀察 造模1周后關(guān)節(jié)軟骨局部出現(xiàn)壞死，成骨區(qū)骨小梁排列基本正常，局部區(qū)域骨陷窩變空，骨細(xì)胞消失，髓腔內(nèi)組織出現(xiàn)壞死；2周后關(guān)節(jié)面軟骨變薄、結(jié)構(gòu)不連續(xù)，部分區(qū)域變性壞死，軟骨下方骨小梁纖細(xì)，排列紊亂，髓腔內(nèi)片狀骨髓造血細(xì)胞凝固性壞死及骨髓脂肪組織液化性壞死；造模4周后關(guān)節(jié)面軟骨破壞加重，軟骨下骨質(zhì)出現(xiàn)修復(fù)跡象；6周后關(guān)節(jié)面軟骨損害繼續(xù)擴(kuò)大，部分區(qū)域出現(xiàn)修復(fù)跡象，形成同源細(xì)胞群，未能修復(fù)區(qū)域由增生的纖維組織代替，軟骨下骨小梁壞死、斷裂，形成死骨，髓腔內(nèi)纖維組織增生；造模8周后軟骨進(jìn)一步塌陷伴軟骨下肉芽組織增生，成骨區(qū)骨小梁大片骨壞死及髓腔內(nèi)纖維化。見圖4。

討 論

目前與ANFH有關(guān)的因素大約有60余種[4]，臨床上大致可分為外傷性和非外傷性兩大類[5]，外傷性主要是由于骨折或脫位導(dǎo)致股骨頭供血血管損傷，直接導(dǎo)致骨缺血壞死；非外傷性病因的致病機(jī)制比較復(fù)雜，或為多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。為尋求理想的治療研究對象，前人對股骨頭壞死動物模型的建立進(jìn)行了很多探討，主要以全身激素型和局部液氮冷凍型為主[6]，孔令擘[7]等對上述兩種主要造模方法進(jìn)行比較，認(rèn)為激素的方法并非一定能引起股骨頭壞死，而液氮冷凍方法建立的兔股骨頭缺血壞死模型方法簡便、壞死明顯。且使用激素僅能復(fù)制早期的病理改變[8]。對實驗動物的選擇也非常廣泛，朱建龍[9]等認(rèn)為符合人類股骨頭壞死病變的病理過程、模型有良好的可重復(fù)性、動物的解剖和生理特點盡可能與人類相似、經(jīng)濟(jì)可行是選擇實驗動物的原則，因此筆者選擇兔作為實驗動物。目前沒有一種方法能夠完全模擬人ANFH發(fā)病過程[10]，但只要模擬出病理過程中的某些重要特征也會對治療研究產(chǎn)生意義。

圖1 造模后1(A)、4(B)、8(C)周X線表現(xiàn)Fig 1 X-ray findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖2 造模后1(A)、4(B)、8(C)周MRI表現(xiàn)Fig 2 MRI findings at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖3 造模后正常側(cè)與實驗側(cè)股骨頭大體比較A：術(shù)后1周；B：術(shù)后4周；C：術(shù)后8周Fig 3 Gross findings in normal and experimental sides of femoral head at weeks 1(A), 4(B), and 8(C) after operation

圖4 造模后組織病理學(xué)觀查A：術(shù)后1周；B：術(shù)后4周；C：術(shù)后8周Fig 4 Histopathological findings at weeks 1, 4, and 8 after operation

以往股骨頭壞死保髖治療的目標(biāo)重在骨的固有病變，忽略了關(guān)節(jié)軟骨的情況。本實驗是模擬中晚期ANFH關(guān)節(jié)面塌陷、軟骨破壞的病理過程，為中晚期股骨頭壞死的治療研究提供適宜的動物模型。本實驗在以往常規(guī)液氮冷凍致股骨頭壞死單因素造模的基礎(chǔ)上，加入了促進(jìn)股骨頭軟骨壞死、剝離的因素。范猛[11]等采用局部冷熱交替損傷建立鴯鹋股骨頭壞死塌陷模型，認(rèn)為在造成骨壞死方面使用冷熱交替的方式優(yōu)于使用單純冷凍的方式。朱曉松等[12]采用將微波天線插入兔股骨頭內(nèi)對股骨頭滅活10min的方法成功造成股骨頭壞死模型，通過實驗得出最佳作業(yè)溫度為55℃，本實驗選擇作業(yè)溫度為100℃，一則是由于烙鐵頭置于股骨頭軟骨表面而非股骨頭內(nèi)，二則微波天線不適用于本方法操作，且電烙鐵最低可調(diào)溫度為100℃，溫度再高可能會導(dǎo)致軟骨下骨質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p傷、壞死面積無法控制。在軟骨表面熱灼的適宜溫度今后還可進(jìn)一步研究探討。

在實驗初期我們嘗試對部分造模后的實驗動物進(jìn)行螺旋CT檢查，結(jié)果造模后4周以前的動物股骨頭在CT掃描下無特殊發(fā)現(xiàn)，而造模2周以后的動物在MRI掃描時股骨頭內(nèi)已有明顯改變，霍現(xiàn)英[13]等研究表明MRI對于早期股骨頭壞死的診斷最敏感、特異性高。因此本實驗采用西門子公司3.0T磁共振儀掃描作為實驗動物的重要造模評價，能夠早期發(fā)現(xiàn)股骨頭病變，同時結(jié)合X線檢查，總體把握股骨頭外形變化。

綜上所述，熱灼聯(lián)合液氮冷凍法能夠模擬出中晚期ANFH關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨質(zhì)塌陷、骨性關(guān)節(jié)炎形成的病理過程，且具有造模時間短、動物死亡率低、造模成功率高的優(yōu)點，可為中晚期ANFH的治療研究提供適宜的動物模型。

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