針刺不同腧穴對失眠模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA影響的實(shí)驗(yàn)研究*

周艷麗

(河南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，鄭州 450008)

睡眠占整個生命的三分之一，幾乎和食物同等重要。失眠給人們帶來的長期痛苦也越來越成為一個公共衛(wèi)生問題［1］。隨著社會的發(fā)展，競爭日趨激烈、自然環(huán)境變化、生活節(jié)奏加快以及人口老齡化及疾病譜的改變，失眠的發(fā)病率急劇上升［2］。針灸治療失眠癥有悠久的歷史，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和良好的效果，具有見效快、作用穩(wěn)定、費(fèi)用低以及改善晨醒后伴隨癥狀明顯等非藥物療法的優(yōu)點(diǎn);且經(jīng)過長期臨床檢驗(yàn)已證實(shí)，針刺治療失眠療效確切、作用持久而穩(wěn)定。但也存在著診療標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、治療方法多樣化、選穴組方差異性較大、缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)等問題。本實(shí)驗(yàn)選取臨床中最常選用的申脈、照海、神門、內(nèi)關(guān)、足三里和三陰交等穴位，觀察針刺上述腧穴對失眠大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA的影響，為臨床治療失眠選穴提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

對氯苯丙氨酸，吉爾生化(上海)有限公司;兔抗5-HT，武漢博士德生物公司;兔抗DA、SABC染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、枸櫞酸緩沖液、PBS緩沖液均由武漢博士德生物公司提供，其他試劑包括甲醛、H2O2、切片石蠟、二甲苯、乙醇等均由天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn);0.35mmx15mm針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠;MP200A型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;KD-BM生物組織包埋機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，德國Leitz公司。

1.2 動物及分組

健康Wistar雌性大鼠 70只，體重 200g±10g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將70只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、空白對照組、神門組、內(nèi)關(guān)組、三陰交組、足三里組、申脈、照海組7組，每組10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)食飲水，室溫20℃～25℃，濕度40%～60%。對氯苯丙氨酸(PCPA)用弱堿性生理鹽水(PH7～8)配置成30mg/ml混懸液備用。除空白對照組外，其余6組大鼠于每日上午腹腔注射 PCPA混懸液 lml/100g，連續(xù)注射2d，空白對照組腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水。于第1次腹腔注射28h～30h后，動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動頻繁，與空白對照組有明顯不同，表明模型復(fù)制成功。大鼠腹腔注射PCPA造模成功后，于次日開始每天早晨8∶00～10∶00進(jìn)行針刺治療，神門組選取神門，內(nèi)關(guān)組選取內(nèi)關(guān)，三陰交取三陰交、足三里組取足三里，申脈、照海組取申脈、照海，空白對照組及模型對照組只抓取不治療。針刺組參照李忠仁［3］主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取相應(yīng)腧穴，以0.5寸毫針進(jìn)行針刺，平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)1min出針，每日1次，連續(xù)7d。于末次針刺治療60min后對大鼠斷頭處死取腦。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)腦組織處理及切片:大鼠斷頭后迅速將腦取出，在冰床上操作，沿腦正中裂將大腦切為左右兩個半球，取右側(cè)腦組織放入4%的甲醛溶液中，4℃條件下固定1周后，行梯度脫水、透明、石臘包埋、切片，每張切片厚6um，進(jìn)行測定指標(biāo)的免疫組織化學(xué)法染色;(2)免疫組織化學(xué)染色:切片常規(guī)脫蠟至水，用 PBS(pH7.4)沖洗3次，每次 3min。切片入3%H2O2水溶液室溫10min，蒸餾水洗滌3次;切片入0.01M枸櫞酸緩沖液(pH6.0)微波加熱修復(fù)抗原，PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3min。滴加正常羊血清封閉，室溫下孵育30min，甩去血清分別滴加一抗(兔抗 5-HT、兔抗 DA)，4℃ 過夜。PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3min。滴加生物素化羊抗兔 IgG，室溫下孵育30min。滴加試劑SABC鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫下 30min。滴加新鮮配制的DAB溶液，鏡下控制反應(yīng)時間。自來水沖洗后，蘇木素復(fù)染，上行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陰性對照:用正常羊血清代替一抗;(3)鏡檢:每張切片分別至少觀察5個具有代表性的視野，顯微鏡觀察，顯示棕黃色顆粒者為陽性，計(jì)數(shù)每個視野中染色陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05、P＜0.01作為顯著性和極顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)比較

表1顯示，干預(yù)后模型組與空白組相比，大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.05);針刺各組與模型組相比，大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);針刺各組與空白組相比，神門組、申脈、照海組、三陰交組大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);內(nèi)關(guān)組、足三里組相比，大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量差異無顯著性意義(P＞0.05);與神門組相比，申脈、照海組大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量差異有顯著性意義(P＜0.05);與三陰交組、內(nèi)關(guān)組、足三里組相比，大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);與申脈、照海組相比，三陰交組、內(nèi)關(guān)組、足三里組大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);與三陰交組相比，內(nèi)關(guān)組、足三里組大鼠腦內(nèi)5-HT免疫陽性細(xì)胞數(shù)量差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠腦內(nèi)DA陽性細(xì)胞表達(dá)的比較

表2顯示，干預(yù)后模型對照組與空白對照組相比，大鼠腦內(nèi)DA陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);模型組與針刺各組大鼠腦內(nèi)DA陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無顯著性意義(P＞0.05);針刺各組之間無明顯差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腦內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

表1 各組大鼠腦內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

注:與空白對照組比較:★P＜0.05;與模型對照組比較:▲P＜0.05;與神門組比較:◆P＜0.05;與申脈、照海組比較:△P＜0.05;與三陰交組比較:◇P＜0.05

組別例數(shù) 5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)空 白 對 照 組 10 23.00±5.00模 型 對 照 組 10 12.00±1.83★足 三 里 組 10 22.71±6.08▲◆△◇內(nèi) 關(guān) 組 10 28.43±4.72▲◆△◇三 陰 交 組 10 37.14±7.54★▲◆△申 脈 、照 海 組 10 43.71±5.85★▲◆神 門 組 10 46.86±4.22★▲

表2 各組大鼠腦內(nèi)DA陽性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

表2 各組大鼠腦內(nèi)DA陽性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

注:與空白組比較:★P＜0.05

組別例數(shù) DA陽性細(xì)胞表達(dá)空 白 對 照 組 10 15.71±2.06模 型 對 照 組 10 35.86±2.67★三 陰 交 組 10 33.00±2.88★足 三 里 組 10 34.57±4.89★內(nèi) 關(guān) 組 10 35.57±3.87★申 脈 、照 海 組 10 38.00±3.37★神 門 組 10 38.71±3.64★

3 討論

睡眠具有明顯的隨晝夜而變更的時間節(jié)律性，衛(wèi)氣晝夜運(yùn)行節(jié)律失調(diào)是失眠的主要發(fā)病機(jī)制。此外，腦為元神之府，若髓海不足、腦失所養(yǎng)，人的思維、感知、睡眠狀態(tài)皆會出現(xiàn)障礙［4］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，古代文獻(xiàn)中記載治療失眠涉及經(jīng)脈7條，穴位多達(dá)65個［5］。

睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的一個主動過程，與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化密切相關(guān)［6］。5-HT、DA是大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT參與如體溫調(diào)節(jié)、情緒活動、痛覺等多種生理功能的調(diào)節(jié)，對睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)作用已被多項(xiàng)研究證實(shí)。5-HT的各受體亞型具有調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期的作用，激動突觸前5-HTIA自身受體，可延長 NREM(包括 SWS)，減少覺醒，對REM無明顯影響;激動突觸后5-HTIA受體，可抑制睡眠(包括REM和5WS)并促進(jìn)覺醒。DA起著維持覺醒和行為興奮的作用。當(dāng)各種原因使其維持覺醒和行為興奮的作用受到抑制時，亦可影響睡眠-覺醒周期［7］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺各組對腹腔注射PCPA所致失眠大鼠的睡眠具有明顯的良性調(diào)節(jié)作用。針刺各組大鼠腦內(nèi)5-HT含量有明顯升高，但對腦內(nèi)DA的含量無明顯作用，提示針刺各組可能通過提高大鼠腦內(nèi)5-HT含量、促進(jìn)睡眠，而非抑制DA合成、抑制大腦興奮來調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期，達(dá)到治療失眠的目的。

實(shí)驗(yàn)研究提示，針刺對失眠有良好的預(yù)防和治療作用。神門對5-HT的作用最好，申脈、照海治療失眠的作用僅次于神門，可作為臨床治療失眠的必選穴位。內(nèi)關(guān)、三陰交、足三里對5-HT的作用，可作為臨床治療失眠且符合辨證的首選穴位。

［1］譚永江，王文龍.科學(xué)睡眠才能保證健康［N］.科學(xué)時報(bào)，2007-3-30(B02).

［2］周靜媛，王宗濤.疏肝解郁、養(yǎng)血活血法治療失眠癥體會［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9(8):2.

［3］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:327.

［4］任珊，孫偉霞.高希言教授針刺治療失眠經(jīng)驗(yàn)探討［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(3):49-50.

［5］劉立公，顧杰.難病針灸典籍通覽［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007:150.

［6］劉林方，等.保神開郁沖劑影響失眠鼠中樞遞質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧中醫(yī)雜，2000，27(2):92.

［7］劉彬，等.保神開郁沖劑影響失眠鼠中樞遞質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2000，27(2):92.