五倍子酸對小鼠胃癌MFC和肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用

王麗萍，曾憲旭，牛鳳蘭，石 卓

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 鄭州 450001

2)吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 長春 130021

3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

4)吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 長春 130021

近年來，通過無毒或毒性較低的植物制劑進(jìn)行化學(xué)治療已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的方法之一[1]，許多天然來源的植物成分在生物系統(tǒng)和動物模型中已顯示出具有化學(xué)預(yù)防和治療的作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一種具有抗氧化活性的天然化合物[2]，廣泛存在于植物中，最初作為抗氧化劑用于防止脂肪等食物腐敗。藥理研究[3]表明，GA不僅具有抗炎、抗菌、抗過敏的活性，且對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[4-6]。該實驗以小鼠胃癌MFC細(xì)胞和肝癌H22細(xì)胞荷瘤小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，觀察GA對上述2種細(xì)胞生長的抑制作用，并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 MFC細(xì)胞和H22細(xì)胞瘤株引自吉林省腫瘤研究所，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時使用。GA由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室提供，用于體外實驗時以二甲基亞砜(DMSO)溶解，用于體內(nèi)實驗時用5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶解。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司。胎牛血清購自杭州四季青生物公司，青霉素、鏈霉素和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由吉林大學(xué)動物中心提供。

1.2 GA體外對2種細(xì)胞生長抑制率的MTT法測定 將處于對數(shù)生長期的MFC及H22細(xì)胞調(diào)整密度為1×105mL－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后，分別加入不同質(zhì)量濃度的GA，使其終質(zhì)量濃度分別為 100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/L，設(shè)在培養(yǎng)液中加入 DMSO為對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，于570 nm波長處測各孔的吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[(1－A(給藥孔)/A(對照孔)]×100%。

1.3 GA體外對2種細(xì)胞周期及凋亡的影響 取對數(shù)生長期的MFC及H22細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入 GA，使其終質(zhì)量濃度為 25.00、12.50和6.25 mg/L，并設(shè)在培養(yǎng)液中加入DMSO為對照組。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，離心，棄上清，用PBS離心洗滌2次，加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇于4℃固定12 h，離心洗滌后加入 200 μL PI染液，50 μL RNA酶，4℃避光放置20～30 min，1500 r/min離心5 min。調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～10)×10 mL－1，上流式細(xì)胞儀分析。

1.4 GA對荷瘤小鼠抑瘤率的影響 2種細(xì)胞的抑瘤實驗相同。取50只昆明小鼠，用無菌生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為5×106mL－1，于小鼠右腋皮下接種MFC細(xì)胞懸液，每只0.2 mL，24 h后采用隨機數(shù)字表法分5組，每組10只。GA高劑量組(GA 0.50 g/kg)，GA 中劑量組(GA 0.25 g/kg)，GA低劑量組(GA 0.20 g/kg)，環(huán)磷酰胺組(環(huán)磷酰胺30.00 mg/kg)，生理鹽水組。實驗組及生理鹽水組經(jīng)灌胃給藥，1次/d;環(huán)磷酰胺組經(jīng)腹腔給藥，隔天1次;連續(xù)給藥10 d。于給藥結(jié)束次日頸椎脫臼處死全部動物，剝?nèi)×鼋M織稱量，計算抑瘤率。抑瘤率 =(1－實驗組瘤質(zhì)量/對照組瘤質(zhì)量)×100%

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析及Dunnet t檢驗比較各組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期分布、荷瘤小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GA對 MFC及H22細(xì)胞的抑制作用 見表1。

表1 GA對MFC及H22細(xì)胞增殖的抑制作用 %

2.2 GA對MFC細(xì)胞周期、凋亡及H22細(xì)胞周期的影響 隨GA質(zhì)量濃度的增加，2組細(xì)胞均發(fā)生G1/G0期阻滯;隨GA質(zhì)量濃度的增加，MFC細(xì)胞的凋亡也逐漸增多，而H22細(xì)胞凋亡率無變化，見表2、3。

表2 GA對MFC細(xì)胞周期和凋亡的影響 %

表3 GA對H22細(xì)胞周期的影響 %

2.3 GA對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 見表4。

表4 GA對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響

3 討論

早在20世紀(jì)90年代，有學(xué)者[4-6]初步證實GA具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，后來人們又相繼證實其在體外對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并初步探討了其作用機制。但這些研究大多致力于體外抗腫瘤活性及其機制的初步探討。

作者以MFC和H22細(xì)胞作為實驗材料，證實了GA具有體外抑制它們生長的作用，并且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。GA對MFC和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用。作者的研究結(jié)果顯示雖然在同等劑量下GA的抑瘤效應(yīng)不如環(huán)磷酰胺，但GA與環(huán)磷酰胺相比有2個優(yōu)點:一方面GA對腫瘤細(xì)胞具有選擇性作用[7-8]，另一方面GA對整體動物的毒性低[9]。

多數(shù)腫瘤的發(fā)生不僅由于細(xì)胞增殖速度快，而且與細(xì)胞死亡速度有關(guān)。細(xì)胞凋亡參與了癌癥的起始過程，并對癌的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用。細(xì)胞周期的控制是細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)機制，一些細(xì)胞毒性藥物通過阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。作者觀察了GA對MFC和H22細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果顯示其可將MFC細(xì)胞阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)MFC細(xì)胞凋亡，提示GA對MFC細(xì)胞的抑制作用可能是通過對該細(xì)胞的G0/G1期周期阻滯作用和誘導(dǎo)凋亡作用實現(xiàn)的。GA可使H22細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，但未見明顯的凋亡增加，提示細(xì)胞周期阻滯是GA抑制H22細(xì)胞增殖的主要原因之一，但增殖抑制作用并非通過促進(jìn)凋亡實現(xiàn)。

[1]呂喆，牛鳳蘭，郗艷麗，等.三羥基苯甲酸純化物及其化合物對Jurkat細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，36(5):904

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[8]Isuzugawa K，Inoue M，Ogihara Y.Catalase contents in cells determine sensitivity to the apoptosis inducer gallic acid[J].Biol Pharm Bull，2001，24(9):1022

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[10]周執(zhí)芬，周云，劉明月.紫杉醇聯(lián)合替尼泊苷對胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，44(5):942