先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1的表達

陳 琦，王 志，曹振杰，趙金磊，馮偉樓

鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’s disease，HD)是新生兒期低位腸梗阻的常見原因之一，其病因尚不十分明確。研究[1]表明在整個神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中都存在NKX2-1的合成。近年來NKX2-1的研究主要集中在甲狀腺、腦部以及肺部等有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病過程[2]，在腸神經(jīng)的研究較少。作者應用免疫組化SP法和RT-PCR技術(shù)檢測NKX2-1在HD患兒結(jié)腸壁肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中的表達，進一步了解NKX2-1在HD發(fā)病中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源 鄭州大學第三附屬醫(yī)院普外科2010年9月至2011年4月臨床確診HD手術(shù)患兒30例，其中男21例，女9例。年齡3 d至5歲，中位年齡13個月。長段型4例，常見型19例，短段型7例。分別取患兒結(jié)腸的狹窄段、移行段和擴張段用于實驗。同時取30例腸套疊手術(shù)患兒切除的正常結(jié)腸標本作為對照，其中男19例，女11例，年齡4個月至2歲，中位年齡14個月。

1.2 NKX2-1蛋白的檢測

1.2.1 試劑及方法 采用免疫組化SP染色法檢測。所有標本均經(jīng)中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，2 μm厚連續(xù)切片。一抗為鼠抗人單克隆抗體(稀釋200倍后使用)，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，二抗和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)服務有限公司，染色步驟嚴格按說明書進行。

1.2.2 結(jié)果判定 用Leica病理圖像采集儀器采集圖像，每例標本隨機選取腸壁全層10個高倍視野，觀察肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的染色情況，以結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒為陽性。參照文獻[3]的標準:未著色為陰性(－)、偶見著色為弱陽性(+)、中等著色為陽性(?)、著色豐富為強陽性(?)。

1.3 NKX2-1 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物購于北京三博志遠生物技術(shù)有限責任公司。NKX2-1引物序列:上游 5’-GCCGAATCATGTCGATGAGTC CA-3’，下游 5’-GTTGCCCAGGTTGCCGTTG-3’，擴增產(chǎn)物大小287 bp。內(nèi)參GADPH引物序列:上游5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下 游 5’-CAC AGTCTTCTGGGTGGC-3’，擴增產(chǎn)物大小 540 bp。RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增的步驟均嚴格按照說明書進行。擴增條件為:95℃變性2 min，95℃預變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。NKX2-1 mRNA的相對表達量用目的基因與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0分析，HD患兒不同節(jié)段結(jié)腸組織和正常對照組結(jié)腸組織中NKX2-1蛋白表達的比較應用兩獨立樣本的秩和檢驗，mRNA相對表達量的比較應用兩獨立樣本的t檢驗或校正t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HD患兒和正常對照結(jié)腸組織肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1蛋白的表達 見圖1、表1。

圖1 HD患兒和正常對照結(jié)腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1蛋白的表達(SP，×400)

表1 HD患兒和正常對照結(jié)腸組織肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1蛋白表達比較

2.2 HD患兒和正常對照結(jié)腸組織肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1 mRNA的表達 見圖2、表2。

圖2 HD患兒和正常結(jié)腸組織肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中NKX2-1 mRNA的表達

表2 HD患兒和正常對照結(jié)腸組織和正常結(jié)腸組織中NKX2-1 mRNA表達比較

3 討論

HD是一種小兒常見的消化道發(fā)育畸形，主要機制是起源于內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)的迷走神經(jīng)嵴的不正常發(fā)育，最后導致腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育缺陷[4]。組織學可見病變段結(jié)腸腸管黏膜下層和肌間神經(jīng)層內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞減少或缺如。Agoff等[2]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)嵴細胞中NKX2-1基因表達控制著神經(jīng)元的分化方向。該基因定位于染色體14q13，其編碼的蛋白產(chǎn)物含有371個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為38000，含有3個外顯子和1個內(nèi)含子，是一個含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其變異會導致神經(jīng)節(jié)細胞的缺如，引起HD的發(fā)生。NKX2-1與腸神經(jīng)元的發(fā)育有一定的聯(lián)系[4-6]?；蛉笔Чδ茉囼炞C實NKX2-1是通過影響中間神經(jīng)元而實現(xiàn)向不同的方向分化，也可以在不同的程序中終止某一中間神經(jīng)元的分化，導致中間神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育終止。在結(jié)腸中NKX2-1主要分布在黏膜下層和肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細胞中[4]。

該研究結(jié)果表明NKX2-1在正常結(jié)腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細胞中有較高表達，但在HD患兒結(jié)腸壁的移行段、狹窄段較正常結(jié)腸組織的表達下降。NKX2-1的這種表達不一致的情況可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟有關(guān)。

綜上所述，推測NKX2-1是保持正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要因素可能與HD的發(fā)生有關(guān)。

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