靶向mTOR siRNA的合成及對MCF-7細(xì)胞mTOR基因表達(dá)的影響

張岳燦，翟娜娜

1)寧波天一職業(yè)技術(shù)學(xué)院人體形態(tài)學(xué)教研室 寧波 315104

2)黃河科技學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室 鄭州 450052

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指小分子雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄后沉默靶基因的表達(dá)。siRNA主要通過特異地與序列互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，并促進(jìn)其降解，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因抑制的作用，最終使靶向基因表達(dá)下調(diào)。RNAi因其可以高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)而迅速成為一種非常有效的在真核細(xì)胞中研究基因功能的工具，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因功能鑒定、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等熱門研究領(lǐng)域，同時也為多種疾病特別是腫瘤的基因治療提供了新的思路[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其在感受營養(yǎng)信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與增殖中起著關(guān)鍵作用[2]。近年來研究[3-7]發(fā)現(xiàn)，mTOR 途徑在腫瘤細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，mTOR信號通路調(diào)節(jié)異常與包括乳癌在內(nèi)的多種腫瘤的形成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，已成為腫瘤治療的新靶點。作者設(shè)計了靶向mTOR的 siRNA，并觀察其對人乳癌 MCF-7細(xì)胞mTOR蛋白及mRNA表達(dá)的沉默作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MCF-7細(xì)胞系由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究所王慶端研究員惠贈;RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司;T7 RiboMAXTMExpress RNAi System、SA-AP、BCIP/NBT購自美國 Promega公司;LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;mTOR鼠抗人多克隆抗體購自美國SAB公司;siRNA模板及5’端生物素標(biāo)記mTOR cDNA探針(5’-CTCAGCGGTAAAAGTGTCCCCTGCCA-3’)由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP試劑盒、胃蛋白酶、預(yù)雜交液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 靶向mTOR siRNA的合成 根據(jù)已知Gen-Bank mTOR mRNA序列和siRNA的設(shè)計原則[4]，利用Promega公司的在線設(shè)計尋找靶序列，并針對mTOR基因的434～452位點設(shè)計合成寡核苷酸模板，序列見表1。按T7 RiboMAX Express RNAi System說明書操作。將各模板的oligo-1和oligo-2、oligo-3和oligo-4分別互補(bǔ)成DNA雙鏈，2條雙鏈DNA分別轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的正義鏈和反義鏈，退火后可得到雙鏈siRNA，經(jīng)純化后重懸于無RNase的水中，以20 bp DNA Ladder為參照，瓊脂糖凝膠電泳，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r設(shè)計合成無義模板，按如上操作得到siRNA-N。

表1 靶向mTOR siRNA轉(zhuǎn)錄模板序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，鏈霉素 100 mg/L)中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80% ～90%融合時分組轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染100和150 nmol/L的 siRNA、siRNAN，正常對照組不轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24、48和72 h時，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為 1 ×106mL－1，以 20 μL/片將細(xì)胞懸液滴于預(yù)處理的載玻片中央，固定備用。

1.4 mTOR蛋白的檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，嚴(yán)格按照免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒說明書操作。以已知mTOR蛋白陽性表達(dá)的食管癌組織作陽性對照[8];以PBS代替一抗作陰性對照。mTOR蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于胞質(zhì)內(nèi)。

1.5 mTOR mRNA的檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)乙醇脫水處理后用體積分?jǐn)?shù)30%H2O21份加純甲醇50份混勻滅活內(nèi)源性過氧化物酶，Triton X-100/PBS進(jìn)行透膜，然后用多聚甲醛及 PBS(pH 7.2～7.6，含有1/1000 DEPC) 暴露mRNA 核酸片段。預(yù)雜交:滴加20 μL/片雜交液，置濕盒內(nèi)，42℃預(yù)雜交3～4 h。雜交:滴加含標(biāo)記cDNA探針(0.3～0.6 mg/L)的雜交液于標(biāo)本上，然后覆蓋蠟?zāi)ぃ?2～43℃雜交12～16 h。雜交后處理:在42℃下應(yīng)用0.1×SSC洗標(biāo)本15 min×4次，以洗脫非特異性雜交。用SA-AP和BCIP/NBT進(jìn)行雜交后顯色。以雜交前用RNase處理的樣本作陰性對照，用已知的mTOR mRNA陽性表達(dá)的食管癌組織作陽性對照[8]。mTOR原位雜交陽性信號定位于胞質(zhì)中，呈藍(lán)紫色，陽性對照均有陽性信號顯示，陰性對照均無陽性信號顯示。

1.6 結(jié)果判定 免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交結(jié)果判定方法為:觀察10個高倍視野，按陽性細(xì)胞數(shù)≤10%、≤30%、≤70%和＞70%分別記為1、2、3和4分。按著色強(qiáng)度:胞質(zhì)內(nèi)可見淺色顆粒，明顯高于背景底色計為1分;胞質(zhì)內(nèi)見較深色顆粒計為2分;胞質(zhì)內(nèi)有大量深色顆粒為3分。上述兩種計分的乘積為最后得分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，4組3個時間點間MCF-1細(xì)胞mTOR蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較應(yīng)用4×3析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞 mTOR蛋白的表達(dá) 見圖1、表2。與siRNA-N轉(zhuǎn)染組和正常對照組比較，mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)均有所降低，但2個mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各組細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)水平未隨轉(zhuǎn)染時間的延長而有所變化。

圖1 轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞mTOR蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 4組細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 4組細(xì)胞 mTOR mRNA的表達(dá) 見圖2、表3。與siRNA-N轉(zhuǎn)染組和正常對照組比較，mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞mTOR mRNA的表達(dá)均有所降低，但2個mTOR siRNA轉(zhuǎn)染組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各組細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)水平未隨轉(zhuǎn)染時間的延長而有所變化。

圖2 轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞mTOR mRNA的表達(dá)(ISH，×400)

表3 4組細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

研究[2]表明mTOR是PI3K/AKT/mTOR信號通路下游的重要效應(yīng)蛋白，它可接收整合生長因子、營養(yǎng)、能量等多種信號，通過PI3K/AKT途徑或AMPK途徑來發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖的中心環(huán)節(jié)。mTOR還能調(diào)控c-myc、cyclinD等多種癌基因的表達(dá)，這些過程都與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)[9-10]，大多數(shù)惡性腫瘤，如非小細(xì)胞性肺癌、腎細(xì)胞癌、白血病、鼻咽癌、喉癌、肝細(xì)胞癌及前列腺癌等，均伴有mTOR信號通路的調(diào)控異常，mTOR信號通路中的相關(guān)激酶大都處于激活狀態(tài)，這些激酶的激活原因很多，包括PTEN功能缺失、Akt擴(kuò)增及結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物突變?nèi)笔У?。mTOR抑制劑雷帕霉素在體內(nèi)外均可特異性地阻斷mTOR/p70S6K信號通路，下調(diào)mTOR的表達(dá)并抑制p70S6K和4EBPI的磷酸化，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[11]。由此可見mTOR信號通路在腫瘤的形成和發(fā)展中扮演著重要角色，并參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[9]。Zhou 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的表達(dá)水平從正常乳腺上皮組織、不典型增生到惡性轉(zhuǎn)化再到腫瘤浸潤漸次增加。

作者設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄合成靶向mTOR siRNA，轉(zhuǎn)染人乳癌MCF-7細(xì)胞后，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法和原位雜交技術(shù)檢測細(xì)胞mTOR蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，靶向mTOR siRNA處理的MCF-7細(xì)胞mTOR蛋白和mRNA的表達(dá)均較正常對照組明顯降低。說明該研究中制備的mTOR siRNA可有效抑制乳癌MCF-7細(xì)胞mTOR蛋白及mRNA的表達(dá)，這為深入研究乳癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及腫瘤靶向治療積累了實驗資料。

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