甘蔗絲氨酸/蘇氨酸激酶基因的克隆及序列分析

陳 玲，葉冰瑩，黃貞杰，張積森，陳由強，陳如凱

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108;2.農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350108;3.發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建 福州 350108)

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是最主要的糖料作物，蔗糖已占我國食糖總產(chǎn)量的90%;同時也是生產(chǎn)乙醇的理想能源作物[1，2]。因此，研究與糖代謝相關(guān)的信號通路具有重要意義。生物體內(nèi)普遍存在的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)方式是蛋白激酶(protein kinase，PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase)催化蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化，這一過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、光合作用、細胞的生長發(fā)育、基因表達、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，甚至癌變等，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中占有極其重要的位置[3]。蛋白激酶可能在酶活的調(diào)控、基因表達和細胞分化方面有一定作用，將激素、代謝和發(fā)育信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑相聯(lián)系[4]。屬于蛋白激酶的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)在植物的生長、轉(zhuǎn)化、基質(zhì)形成及凋亡的生理過程中起著重要作用[5]，通過催化糖代謝中相關(guān)酶的磷酸化與去磷酸化，從而影響甘蔗的糖分積累。

基因克隆是分子生物學(xué)的起點，要研究基因的結(jié)構(gòu)或者是功能都必須先獲得相應(yīng)的基因序列[6]。本研究從甘蔗中克隆獲得STK基因cDNA片段，并在此基礎(chǔ)上采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)擴增甘蔗STK基因cDNA的5'及3'端序列，從而為甘蔗STK的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品種FN 28由甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點開放實驗室育種組提供。

1.1.2 試劑 Trizol購自Invitrogen;焦碳酸二乙酯(DEPC)購自Sigma;PrimeScriptTMRT-PCR Kit、TaKaRa Ex Taq酶、EcoRⅠ購自TaKaRa;羧芐青霉素Carb購自上海生物工程公司;SV Gel and PCR Clean-Up System購自Promega;SMARTTMRACE cDNA Amplification kit購自Clontech。

1.1.3 菌種與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，pMD-19T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗STK基因cDNA片段的克隆 (1)PCR引物設(shè)計。以NCBI登錄號為 EC277889.1的玉米序列為種子序列，利用甘蔗EST數(shù)據(jù)庫篩選同源序列并進行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計上下游電子克隆引物。STK1上游:5'CGATGAAGATACCCAAGTACCAGACACC3';STK2下游:5'TACAAGAGGAGGGAGAGAAGCGAAGC 3'。(2)甘蔗葉與莖總RNA的提取及cDNA的合成。根據(jù)Trizol說明書提取蔗葉和莖的總RNA，cDNA合成應(yīng)用PrimeScriptTM1st strand cDNA synthesis Kit。(3)甘蔗STK cDNA的克隆及序列分析。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。反應(yīng)總體積為 50 μL，含 ddH2O 33.5 μL，Ex Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物 STK1、STK2 各 1 μL，模板cDNA第一鏈5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL。序列分析采用GenBank數(shù)據(jù)庫Blast在線分析軟件及DNAMAN等軟件。

1.2.2 甘蔗STK基因cDNA的5'UTR及3'UTR的擴增 (1)引物設(shè)計:根據(jù)已克隆得到的STK基因cDNA序列設(shè)計相應(yīng)引物。5'-RACE引物R5為:5'TGTCCCATCAGCACAGTAACCAAGCAAC 3';3'-RACE引物R3為:5'AATATCCAGGACACCATCCAGCAAGGGC 3'。

(2)PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。反應(yīng)總體積為 20 μL，含 ddH2O 11 μL，Ex Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，上游引物 R5 或 R3(4 μmol·L-1)、下游引物 UPM(通用接頭引物)各2 μL，模板 cDNA 第一鏈1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.4 μL。序列分析采用GenBank數(shù)據(jù)庫Blast在線分析軟件及DNAMAN等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗葉與莖總RNA提取

本研究所提取的蔗莖與蔗葉總 RNA 濃度如下:C(莖)=565 μg·mL-1，D260nm/280nm(莖)=2.07，D260nm/230nm(莖)=2.10;C(葉)=1154 μg·mL-1，D260nm/280nm(葉)=2.03，D260nm/230nm(葉)=2.18，完整性較好，蛋白質(zhì)和多糖含量較少，具有較高的純度，符合合成cDNA以及RACE的要求(圖1)。

2.2 甘蔗STK cDNA的克隆

從圖2可見，PCR擴增出了約1092 bp的基因片段，條帶單一、清晰。菌液PCR后用EcoRⅠ進行單酶切鑒定，載體pMD-19T大小為2692 bp，目的片段約1092 bp，重組質(zhì)粒約3800 bp，用EcoRⅠ酶切后條帶大小與理論相符(圖3)。

2.3 PCR擴增5'UTR及3'UTR

5'RACE PCR擴增出了約800 bp的基因片段(圖4)，3'RACE PCR擴增出了約1000 bp的基因片段(圖5)。

2.4 序列分析

5'、3'端序列與中間片段重疊延伸后總片段長為1133 bp，其中5'UTR為54 bp，3'UTR為254 bp，包含完整的ORF(825 bp)，共編碼274個氨基酸(圖6)。Open Reading Frame Finder確定其為絲氨酸/蘇氨酸激酶，已將此序列上傳 NCBI，GeneBank登錄號為 JX105518。通過預(yù)測(∥cn.expasy.org/too1s)，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 29.9052 ku，理論等電點為 6.36。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoretogram

將測序結(jié)果與NCBI的數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的植物進行系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，并借助軟件ClustalX 1.83及BioEdit進行序列之間的比對，而后采用MEGA(Version 4.0)軟件包中的Kimura two-parameter矩陣模型和Neighbor-joining法進行進化樹的構(gòu)建，與高粱、玉米、水稻、短柄草、大麥的相似性分別為97%、94%、89%、89%和88%(圖7)。

采用NCBI Blast分析程序?qū)ν茖?dǎo)的氨基酸序列進行保守區(qū)域分析表明，甘蔗STK氨基酸系列擁有完整的STK基因家族保守區(qū)PKc域(圖8)。

3 討論

本研究通過RACE技術(shù)獲得長為1133 bp的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因片段，其中5'UTR為54 bp，3'UTR為254 bp，包含完整的ORF(825 bp)，共編碼274個氨基酸，其編碼的氨基酸具有明顯的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。Hanks et al[7]認為蛋白激酶含有11個子域，第Ⅵ子域賦予了絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性[7-9]，因此，可以根據(jù)第Ⅵ子域保守基序DLKXXN[7]確定絲氨酸/蘇氨酸序列。

多數(shù)情況下，我們僅了解植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個組分，并不了解整個通路的各個組分。因此若要研究STK的信號通路，就需要探測其上下游各組分，以分別鑒定各自的調(diào)控子和靶蛋白。后續(xù)工作可通過酵母雙雜交和生化分析來研究STK的生理生化功能[10，11]。

為進一步研究STK基因各種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物學(xué)功能，本研究擬構(gòu)建甘蔗STK基因的植物表達載體轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，并進行相關(guān)研究。初步研究探討STK在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，尤其是STK在蔗糖代謝中的作用。

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