某地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關基因突變特征分析＊

楊 輝，張國良，張明霞，陳心春，陳建波，吳愛武

（1.廣州醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系 510182；2.廣東省深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所 518112；3.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科 510120）

某地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關基因突變特征分析＊

楊 輝1，2，張國良2，張明霞2，陳心春2，陳建波2，吳愛武3△

（1.廣州醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系 510182；2.廣東省深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所 518112；3.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科 510120）

目的了解深圳地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株利福平和異煙肼的耐藥相關基因的突變特點。方法60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株通過全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定系統(tǒng)（BACTEC－MGIT960）進行鑒定和藥敏分析。在這60株菌株中，針對包括利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）在內(nèi)的rpoB基因和異煙肼耐藥相關位點katG315、inhA－15、kasA269、kasA312進行PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物T－A克隆后進行測序。結(jié)果在60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，檢出利福平耐藥株45株，敏感株15株；異煙肼耐藥株41株，敏感株19株；利福平和異煙肼同時耐藥的有14株。在45株利福平耐藥株中，rpoB基因RRDR突變發(fā)生率為91.1%（41／45），共檢測到12種突變形式，主要突變位點在531、526、516、533，以Ser531Leu突變最常見，占rpoB發(fā)生基因突變株的51.2%（21／45）。在41株異煙肼耐藥株中，katG315位點有29株發(fā)生突變，包括28株katG315（AGC－ACC）和1株katG315（AGC－AAC）突變，突變發(fā)生率為70.7%（29／41）；inhA－15位點有9株發(fā)生突變，均為（C－T）突變，突變發(fā)生率為21.95%（9／41）。kasA基因未發(fā)現(xiàn)常見突變形式。結(jié)論深圳地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關基因突變位點與國內(nèi)外研究基本一致，但各位點頻率有所不同。

分枝桿菌，結(jié)核；藥物耐受性；突變

結(jié)核病是嚴重危害人們身體健康的重大公共衛(wèi)生問題，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報告，全球?qū)⒔?／3的人口曾經(jīng)或正在感染結(jié)核分枝桿菌，每年約900萬人發(fā)展為活動性結(jié)核病，近300萬人會發(fā)展成為耐多藥結(jié)核病，并有180萬人死于該病。耐多藥結(jié)核病是指至少同時對兩種主要臨床一線藥物利福平和異煙肼都耐藥的結(jié)核病［1］。本研究通過基因測序來分析結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB和異煙肼耐藥基因katG、inhA啟動子、kasA的突變情況，探討結(jié)核分枝桿菌耐藥的特點，為建立快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株DNA由香港大學微生物實驗室饋贈。60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于2010年8月至2011年8月深圳市第三人民醫(yī)院住院的危重結(jié)核患者。

1.2 儀器與試劑 采用全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)（BACTEC－MGIT960）、高速離心機、恒溫箱、Qiagen公司的基因提取試劑盒、Axygen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒、Takara公司的PCR反應試劑（DRR006B）和T載體試劑盒（D101A）。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 實驗完全按照全國結(jié)核病細菌學檢驗標準化規(guī)程進行，標本在Middlebrook7H9結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。并用全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)進行檢測。

1.3.2 細菌DNA的制備 吸取1mL培養(yǎng)陽性的 Middlebrook7H9結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)基，在100℃恒溫箱中溫浴30min進行滅活，然后使用Qiagen公司的細菌基因提取試劑盒進行核酸抽提，操作按其說明書進行。

1.3.3 目的基因擴增 針對rpoB基因的RRDR、katG315、inhA啟動子區(qū)－15位點和kasA基因269和312位點進行設計引物，引物由深圳凱杰生物公司設計，上海生工公司進行合成，引物設計見表1。

表1 目的基因擴增所用的引物序列及長度

1.3.4 PCR檢測 PCR反應體積為50μL，其中DNA 2μL，Ex Taq酶2U，引物各20μmol，dNTP混合液4μL，10×Ex Taq緩沖液5μL，其余由蒸餾水補足。擴增條件為:95℃變性10min；95℃30s，58℃20s，72℃20s共30個循環(huán)；72℃維持10min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用AxyGen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行核酸純化，操作按照說明書進行。使用Takara公司T載體試劑盒，操作按說明書進行，將純化好的核酸轉(zhuǎn)入T載體后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，并在LB固體培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選培養(yǎng)。挑選LB固體培養(yǎng)基上白色單克隆菌落，進行菌落PCR驗證為陽性克隆后送到華大基因公司進行測序。測序結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株進行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀器檢測結(jié)果 在被檢測的60株標本中，利福平耐藥株45株，敏感株15株；異煙肼耐藥株41株，敏感株19株；利福平和異煙肼同時耐藥的有14株。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1。

2.3 rpoB基因檢測突變的結(jié)果 目的基因被擴增的片段為488 bp，rpoB包含了81bp的利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）。RRDR在60個菌株中檢測結(jié)果（表2），15株敏感株均未發(fā)生突變。45株利福平耐藥株中有41株存在rpoB突變，即91.1%（41／45）的利福平耐藥菌株存在rpoB突變。在這41株rpoB突變株中發(fā)生單一突變的菌株有32株，多突變位點重合突變的有8株，1株出現(xiàn)rpoB基因510和511位點缺失。其中最易發(fā)生突變的位點為531位點，突變率為51.2%（21／41）；其次為526、516位點，這3個位點共占rpoB基因突變的82.9%（34／41），測序結(jié)果見圖2。

2.4 katG基因檢測結(jié)果 41株存在katG基因突變，其中24株為單個點突變，15株存在聯(lián)合突變，2株存在插入序列。在24株單點突變中，有17株為katG315（AGC－ACC）突變，1株為katG315（AGC－AAC）突變。在15個聯(lián)合突變中有11個存在katG315（AGC－ACC）突變，結(jié)果表明在異煙肼耐藥株中，katG315位點突變的發(fā)生率為70.7%（29／41），其余總共25種突變形式暫未發(fā)現(xiàn)其突變作用。

2.5 inhA啟動子區(qū)基因檢測結(jié)果 9株結(jié)核分枝桿菌存在inhA基因啟動子－15位點C－T突變，占異煙肼耐藥株的21.95%（9／41），其他還存在11種不同突變。

圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株rpoB、katG、inhA和kasA基因擴增結(jié)果

表2 RRDR基因突變情況

圖2 常見位點測序結(jié)果

2.6 kasA基因檢測結(jié)果 存在23種突變，均為單堿基突變，未發(fā)現(xiàn)常見突變269突變和312突變。

3 討 論

利福平和異煙肼是治療結(jié)核分枝桿菌感染的首選藥物，特別是在短期治療中起到重要的作用。耐多藥結(jié)核的產(chǎn)生給患者治療帶來更大困難，包括治療費用增加、治愈率下降、病死率增高等。目前，結(jié)核病的控制情況不容樂觀，相關保障措施不夠，耐藥結(jié)核病的控制亟待開展，診斷耐多藥／廣泛耐藥結(jié)核病還面臨很大的挑戰(zhàn)［2］。針對日益嚴重的結(jié)核病疫情，早期鑒定結(jié)核耐藥已成為迫切需要。利用培養(yǎng)的方法進行結(jié)核菌藥敏試驗是臨床分離結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的標準方法，但由于其培養(yǎng)周期太長，不能及時滿足臨床治療的需要，因此檢測結(jié)核分枝桿菌對常用抗結(jié)核藥物的耐藥位點突變情況，是快速了解結(jié)核分枝桿菌對常用抗結(jié)核藥物是否敏感的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌rpoB基因發(fā)生突變是利福平耐藥的主要原因，突變主要發(fā)生在RRDR，這一區(qū)域中不同位點突變的頻率不同，其中主要以531、526和516為主［3－6］。rpoB基因是細菌RNA聚合酶的β亞基的編碼基因，當RRDR突變時，DNA依賴的RNA聚合酶B亞單位結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)生耐藥［7］。本研究結(jié)果表明，15株敏感株在rpoB中均未發(fā)生突變，45株耐藥株中有41株在rpoB發(fā)生了突變，共有12種突變形式，其中最主要的突變形式Ser531Leu（51.2%），其次為526、516、533等密碼子突變。在41株突變菌株中，32株為單堿基突變，7株為雙堿基突變，1株3個堿基突變，1株出現(xiàn)510和511位點缺失，主要以單點突變?yōu)橹?。本研究與2010年報道的廣東地區(qū)rpoB基因突變的結(jié)果相似，說明快速檢測這些位點是否存在突變可作為判斷結(jié)核分枝桿菌是否對利福平耐藥的依據(jù)［8］。但本次測序結(jié)果有1株結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)了510和511的缺失，說明rpoB基因RRDR可能不是結(jié)核分枝桿菌生存所必須。與國外報道相比，531的突變頻率有所降低。各地rpoB基因位點突變頻率的不同，可能與當?shù)亟Y(jié)核病的傳播途徑和進化有關。

本研究選取異煙肼常見耐藥基因突變進行檢測，探討其在深圳地區(qū)耐藥相關基因的突變特點。異煙肼主要通過抑制結(jié)核分枝桿菌分枝菌酸的生物合成，導致細菌細胞壁破損，從而殺滅細菌。異煙肼的耐藥機制非常復雜，涉及katG、inhA、oxyR－ahpC、kasA和ndh等基因［8］。根據(jù)國內(nèi)外報導，katG315位點和inhA－15位點占異煙肼耐藥的80%以上［9－11］。在本次測序結(jié)果中，共有29株存在katG315突變，其中包括28株katG315（AGC－ACC）和1株 katG315（AGC－AAC），9株存在inhA－15（C－T）突變，同時存在katG315和inhA－15位點突變的共有3株，但是本研究并未發(fā)現(xiàn)已有文獻報道的katG279位點突變和inhA－8位點突變［12－14］。同時本次測序未發(fā)現(xiàn)kasA基因常見突變位點kasA269和kasA312突變，說明在深圳地區(qū)由于kasA基因突變導致異煙肼耐藥的發(fā)生頻率較低，或也不排除是因為樣本量較少或者抽樣原因?qū)е隆?/p>

本研究采用基因測序的方法來分析結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對利福平和異煙肼耐藥基因的特點，為建立快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因提供實驗室依據(jù)。

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The characterization of gene mutation in rifampin and isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolated from a city＊

Yang Hui1，2，Zhang Guoliang2，Zhang Mingxia2，Chen Xinchun2，Chen Jianbo2，Wu Aiwu3△（1.Department of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical College，Guangzhou，
Guangdong510182，China；2.Liver Disease Research Institute，the Third People＇s Hospital of Shenzhen，Shenzhen，Guangdong518112，China；3.Department of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou，Guangdong510120，China）

ObjectiveTo investigate the characterization of gene mutation in Rifampin and Isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis isolated from Shenzhen.Methods60Mycobacterium tuberculosis clinical strains were identified and their drug resistance in phenotype were tested by BACTEC MGIT960，rpoB，katG315，inhA 15，kasA269and kasA312genes were amplified by PCR and the fragments were cloned into T vector and sequenced.ResultsAmong the 60Mycobacteria tuberculosis clinical strains，45rifampicin resistant strains and 15rifampicin susceptible strains；41isoniazid resistant strains and 19isoniazid susceptible strains；14multiple drug resistance strains were detected.About 91.1%（41／45）of Mycobacterium tuberculosis isolates in 45rifampicin drug resistant strains has mutations in rpoB and there were 12different mutations，gene locus 531、526、516、533mutation had a higher frequency especially gene locus 531which had 51.2%（21／41）of mutational rate in 41strains with rpoB gnen mutation.Point mutations at gene locus katG315including katG315（AGC－ACC）in 28isoniazid resistance strains and katG315（AGC AAC）in 1isoniazid resistance strain，were found in 70.7%（29／41）of isoniazid resistant strains.21.95%（9／41）of Mycobacterium tuberculosis isoniazid resistant strains had inhA－15（C－T）mutations，no mutation in kasA was found in the study.ConclusionOmpared with other studies，the mutational gene site of Mycobacterium tuberculosis isolates with drug esistance of rifampicin and isoniazid in Shenzhen were consistant，but the gene mutation frequency in common gene locus of drug esistance were different.

mycobacterium tuberculosis；drug tolerance；mutation

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.006

A

1671－8348（2012）34－3591－03

國家自然科學基金資助項目（81172732）。 △

，Tel:13660281744；E－mail:aiwwu66＠163.com。

2012－06－09

2012－08－22）