HRM－非標記探針法檢測IL－15基因SNPs方法的建立＊

王 玥，鄭啟城，姚秀云，鄧 兵，憲 瑩，于 潔

（重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地 400014）

HRM－非標記探針法檢測IL－15基因SNPs方法的建立＊

王 玥，鄭啟城，姚秀云，鄧 兵，憲 瑩，于 潔△

（重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地 400014）

目的建立用于檢測白細胞介素－15（IL－15）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點的高分辨率熔解曲線（HRM）－非標記探針的方法。方法采用HRM－非標記探針法及小片段擴增法對80名健康兒童IL－15基因4個SNPs位點進行基因分型，采用基因測序法進行驗證并同時與小片段擴增法分型結(jié)果進行比較。結(jié)果HRM－非標記探針法與基因測序分型結(jié)果一致，準確率為100%；未加入溫度內(nèi)標的小片段擴增法不能區(qū)分野生純合子和突變純和子。結(jié)論HRM－非標記探針法是對已知SNP位點突變研究的一種廉價、簡便、準確的基因分型技術(shù)，適合于對已知的SNP位點或基因突變進行分型和檢測。

白細胞介素15；多態(tài)性，單核苷酸；高分辨率熔解曲線分析；非標記探針法

高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）分析技術(shù)是一種新的DNA突變檢測技術(shù)，其原理是通過摻入飽和熒光染料實現(xiàn)對DNA雙鏈熔解過程的監(jiān)控，再利用Tm值的差異和熔解曲線的形狀來區(qū)別突變［1］。HRM屬于全閉管式操作，前期的PCR和后期的熔解曲線分析均在一個管內(nèi)完成，不需要對PCR產(chǎn)物進行分離和處理。與單鏈構(gòu)象分析、高效液相色譜、變性梯度凝膠電泳、毛細管凝膠電泳等方法相比，HRM減少了交叉污染的概率并且節(jié)省了后期操作的成本和時間。此外，由于HRM不對PCR產(chǎn)物進行酶切等操作，不影響產(chǎn)物完整性，因此分析后的樣品能夠繼續(xù)用于后續(xù)試驗，如凝膠電泳、測序等，利用HRM技術(shù)進行基因分型的常用方法有兩種:小片段擴增法和非標記探針法。目前，國內(nèi)較多報道是采用小片段擴增法進行基因突變的篩查和基因分型，其弱點是對野生純合子和突變純合子以及對G／C突變及A／T突變的區(qū)分能力較差，需要額外引入溫度內(nèi)標或已知基因分型的樣品進行區(qū)分［2］。而使用非標記探針法直接針對SNPs位點進行設(shè)計，能夠較好地區(qū)分野生純合子和突變純合子，尤其是G／C突變和A／T突變，故較適用于已知SNPs的基因分型，但目前在國內(nèi)應(yīng)用HRM－非標記探針法進行基因分型的研究報道較少。

白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率為3～5／10萬，占兒童惡性腫瘤的35%以上，其中又以急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）為主，占70%～80%；該病發(fā)病機制未完全闡明，并且在現(xiàn)行化療方案下仍有部分患兒無法獲得臨床緩解或者發(fā)生復(fù)發(fā)［3－4］。2003年，本院對193例ALL患兒治療情況進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)仍有9%無法達到臨床緩解；隨訪22例進入維持治療期的患兒，其中4例復(fù)發(fā)［5］。因此，為進一步提高ALL患兒的治愈率，應(yīng)繼續(xù)尋找與ALL治療不緩解以及復(fù)發(fā)相關(guān)的危險因素。最近，一項基于全基因組范圍的SNPs篩查研究發(fā)現(xiàn)，位于IL－15 3′端非翻譯區(qū)（3′－UTR）的5個SNPs位點（rs17007695、rs35964658、rs10519613、rs10519612和rs17015014）與兒童ALL治療后微小殘留病陽性密切相關(guān)［6－7］。為進一步證實上述位點與中國白血病患兒發(fā)病及預(yù)后的相關(guān)性，本研究選取IL－15SNPs位點為研究對象，擬對IL－15SNPs位點進行基因分型，而其中關(guān)鍵的技術(shù)的是IL－15SNPs的基因型檢測。鑒于HRM技術(shù)的優(yōu)點，以及待分析的IL－15SNPs位點中包含C／G突變，因此本文選取了基于Light Scanner96HRM檢測儀的HRM－非標記探針法，并應(yīng)用該方法首先對健康兒童的IL－15 3′－UTR單個核苷酸多態(tài)性位點進行基因分型，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有80例樣本來源于既往本院進行兒童流行病學調(diào)查時所凍存的健康體檢兒童外周血樣本。采用TIA Namp Genomic DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

1.2 HRM 檢測

1.2.1 引物及探針的設(shè)計和合成 在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中輸入SNP識別號，獲取SNP位點前后250bp片段（參考序列 NC＿000004.11，IL－15范 圍:142，557，749－142，655，140）。利 用 Primer－Blast網(wǎng) 站 （http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primer－blast）設(shè)計高特異性引物，并將產(chǎn)物長度限制在100～300bp。采用Oligo6軟件對引物進行驗證，剔除含有會影響擴增效率的引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物對。設(shè)計非標記探針與野生型互補，其3′末端采用 C－3spacer法封閉。rs17007695上游:5′－TGA GGC TAC GTC AGA GCT AGG CAT－3′，下游:5′－CCA CCT CGA GCC TGG TAC AAC A－3′，探針:5′－TAC CAT TGG CTT TCT TTG AAA ATC ACA CAT－3′（250bp）；rs35964658 上 游:5′－CCC TTA GCC CCC AGC AAT GAG C－3′，下游:5′－TGG AGA AGG TGT GGC TTA CCC C－3′，探 針:5′－TCA AAT GAC CAC ACT TTA ATT TTC CAG C－3′（297bp）；rs10519613上游:5′－GCA AAG AAT GTG AGG AAC TGG AG－3′，下游:5′－TGC CTT CAT TTC TAA GAG TTC ATC TG－3′，探針:5′－ACT CGG CAT TTC AAA TGT GCT GTC A－3（254bp）；rs17015014上游:5′－ACA CTG GGG CTG AAG CAC ATC T－3′，下 游:5′－AGC CAA CAC CCT CAT CCC TTT GC－3′，探針:5′－GAA GCA AGT TTG CTG TAA AGA TGC TA－3′（194bp）。引物和探針均由上海生生物工程有限公司合成。

1.2.2 不對稱PCR擴增 使用 Mastercycler梯度聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國Eppendorf公司）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)用2×Hotstrat Taq PCR Master Mix試劑（北京天根生化科技有限公司）進行擴增，熒光染料用高分辨率的飽和LC Green熒光染料試劑（美國Idaho公司）。反應(yīng)體系包括:DNA模板1 μL（1ng／μL），PCR Master Mix（2× ）5μL，上 游 引 物 （1 μmol）、下游引物（5μmol）各1μL，探針（2.5μmol）1μL，LC Green熒光染料（10×）染料1μL。PCR擴增條件為:95℃ 預(yù)變性120s；然后95℃30s，63℃30s退火，72℃30s延伸，共55個循環(huán)以促進引物的消耗，確保單鏈的大量合成；95℃60s，15℃停止，促進異源雙鏈核酸分子形成。

1.2.3 HRM分析進行基因分型 采用Light Scanner96HRM檢測儀（美國Idaho公司）對PCR產(chǎn)物進行基因分型。檢測溫度范圍為60～85℃，每升高0.1℃采集1次熒光亮度數(shù)據(jù)。獲得原始熔解曲線圖后，Light Scanner96分析軟件即自動對背景信號和孔間熒光信號進行校正。選定探針峰熔解曲線范圍后，軟件生成標準化后的熔解曲線圖，并行自動基因分型。

2 結(jié) 果

Light Scanner96HRM檢測儀一次掃描可對96個樣本進行熔解曲線分析，每次分析用時約8min。60～85℃范圍內(nèi)共產(chǎn)生兩個熔解曲線峰，低溫區(qū)的為探針峰，高溫區(qū)的為產(chǎn)物峰。通過將分析范圍限制在探針峰區(qū)域并經(jīng)行轉(zhuǎn)換生成衍生圖后，純合子的熔解曲線為單峰、雜合子為雙峰。由于所有的非標記探針設(shè)計與野生型互補，故野生型的Tm值高于突變型，Tm差值為3～6℃。根據(jù)探針峰的數(shù)目、峰型以及Tm值，采用Light Scanner軟件對樣本進行自動分型，見圖1。筆者采用非標記探針法、小片段擴增法及測序法對這80份健康漢族兒童標本進行了以上4個位點的測定。非標記探針法分型結(jié)果與測序結(jié)果一致，準確率為100%（表1）；另一方面，由于未加入高低溫內(nèi)標，小片段擴增法僅能夠區(qū)分雜合型和純合型，但對進一步區(qū)分野生純合型和突變純合型的能力較差。rs17015014G＞C位點48個樣本的兩種分型方法結(jié)果，見圖2。

圖1 HRM－非標記探針法的基因分型

圖2 非標記探針法與小片段擴增法分型比較

表1 80例樣本基因分型結(jié)果

2 討 論

HRM分析是近年來興起的SNPs篩查和基因分型的技術(shù)，并且因其高通量、高準確性以及廉價的特點而受到了越來越多的關(guān)注和應(yīng)用［8－9］。常用的HRM分析法有小片段擴增法和非標記探針法。小片段擴增法多被用于測序前的突變篩查，以減少測序的工作量。其缺點是在用于G／C突變（Ⅲ類突變）或A／T突變（Ⅳ類突變）的基因分型時，由于Tm值相差太小，往往不容易將野生純合子和突變純合子分開。在本實驗中也進行了小片段擴增法分析，但未能夠得到準確的分型結(jié)果，考慮與所設(shè)計的擴增產(chǎn)物片段較大（194～297bp）以及未加入高低溫內(nèi)標作孔間溫度校正有關(guān)。此外，高通量HRM檢測儀（96／384孔）由于存在孔間溫度差異問題，需要在每個反應(yīng)孔內(nèi)都加入一對同樣經(jīng)過3′端封閉的高低溫內(nèi)標進行溫度校正，因此在費用方面并不比非標記探針法更低廉。

非標記探針法基本原理同小片段擴增法，都是通過比較Tm值差異進行基因分型。但與小片段擴增法比較產(chǎn)物的熔解曲線不同，非標記探針法比較的是探針與產(chǎn)物的熔解曲線。由于加入的探針長度較短（20～40bp），增加了的Tm值差距（＞3℃），因此非標記探針法在區(qū)分G／C突變（Ⅲ類突變）和A／T突變（Ⅳ類突變）時更具有優(yōu)勢。本實驗涉及的4個SNP位點中即包含一個G／C突變。結(jié)果顯示非標記探針法對該位點的區(qū)分清楚、分型準確，以測序法為標準其準確率可達100%。Liew等［10］對小片段擴增法和非標記探針法進行了對比，發(fā)現(xiàn)在擴增片段小于100bp時，小片段擴增法與非標記擴增法的分型結(jié)果一致，準確率都能夠達到100%；但當擴增片段大于200bp時，由于小片段擴增法中野生／突變純合子間的Tm值差異減小，從而導致了分型準確性下降。另外，由于有研究提到了可以采用低分辨率的熒光定量PCR儀對非標記探針進行基因分型，因此，筆者也試圖利用Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀對PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析，但結(jié)果未見熔解曲線中有明顯的探針峰，并且利用產(chǎn)物峰亦不能分型，考慮可能與機器激發(fā)光源和LCGreen染料不匹配和不能將數(shù)據(jù)導出到Light Scanner軟件進行分析有關(guān)。

非標記探針法中，探針設(shè)計是實驗成功的關(guān)鍵。經(jīng)驗表明，22bp以上的探針長度能夠提供足夠強的探針峰熒光強度；探針Tm值最好在55～70℃，以避免與引物二聚體Tm范圍重疊（通常在75～80℃）及影響產(chǎn)物的擴增。盡管通過以上方法已能夠?qū)Υ蟛糠諷NPs或基因突變進行分型檢測，但更復(fù)雜的基因分型，比如基因突變合并單核苷酸多態(tài)性、相鄰位點的多個基因突變等，仍然給非標記探針法帶來了挑戰(zhàn)。由于受到同一擴增片段中的相鄰的突變位點或SNP位點的干擾，野生型和突變型的探針峰熔解曲線可能會很相似，因此無法順利進行區(qū)分。Poulson等［11］以隔離－探針 PCR（iolated－probe PCR，IP－PCR）實驗平臺為基礎(chǔ)，通過設(shè)計兩個Tm值差距較大的非標記探針成功地對同一擴增片段中相隔46bp的兩個SNP位點同時進行基因分型，節(jié)約了實驗成本；Margraf等［12］則是通過采用“遮蔽技術(shù)”，即將非標記探針上的一個或多個突變／SNPs位點進行遮蔽（錯配法、位點刪除法或通用堿基法），排除了鄰近單核苷酸多態(tài)性位點或突變位點帶來的干擾，清楚的識別出了存在突變的樣本。這些方法的提出使非標記探針法具有了對較復(fù)雜的突變／SNPs位點進行分型的能力，拓寬了非標記探針法的應(yīng)用范圍。

綜上所述，非標記探針法在區(qū)別Ⅲ、Ⅳ類突變時較小片段擴增法更具有優(yōu)勢、實驗成本更低廉，更適合于對已知的SNPs位點或基因突變進行分型和檢測。

［1］Wittwer CT，Reed GH，Gundry CN，et al.High－resolution genotyping by amplicon melting analysis using LC Green［J］.Clin Chem，2003，49（6）:853－860.

［2］張建佚，馮潔，楊澤，等.高分辨率熔解曲線小擴增子法結(jié)合混樣法在線粒體13928G＞C突變分析中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2009，4（6）:445－448.

［3］張義瓊，朱易萍，廖清奎.兒童急性淋巴細胞白血病治療和預(yù)后進展［J］.中國實用兒科雜志，2006，21（10）:786－789

［4］M?ricke A，Reiter A，Zimmermann M，et al.Risk－adjusted therapy of acute lymphoblastic leukemia can decrease treatment burden and improve survival:treatment results of 2169unselected pediatric and adolescent patients enrolled in the trial ALL－BFM 95［J］.Blood，2008，111（9）:4477－4489.

［5］于潔，徐酉華，憲瑩，等.兒童急性淋巴細胞白血病3年臨床總結(jié)［J］.重慶醫(yī)學，2003，3（10）:1326－1329.

［6］Yang JJ，Cheng C，Yang W，et al.Genome－wide interrogation of germline genetic variation associated with treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.JAMA，2009，301（4）:393－403.

［7］Lin D，Liu C，Liu H，et al.The role of interleukin－15polymorphisms in adult acute lymphoblastic leukemia［J］.PLoS One，2010，5（10）:e13626.

［8］Vossen RH，Aten E，Roos A，et al.High－resolution melting analysis（HRMA）:more than just sequence variant screening［J］.Hum Mutat，2009，30（6）:860－866.

［9］Montgomery JL，Sanford LN，Wittwer CT.High－resolution DNA melting analysis in clinical research and diagnostics［J］.Expert Rev Mol Diagn，2010，10（2）:219－240.

［10］Liew M，Seipp M，Durtschi J，et al.Closed－tube SNP genotyping without labeled probes／a comparison between unlabeled probe and amplicon melting［J］.Am J Clin Pathol，2007，127（3）:341－348.

［11］Poulson MD，Wittwer CT.Closed－tube genotyping of apolipoprotein E by isolated－probe PCR with multiple unlabeled probes and high－resolution DNA melting analysis.［J］.Biotechniques，2007，43（1）:87－91.

［12］Margraf RL，Mao R，Highsmith WE，et al.RET proto－oncogene genotyping using unlabeled probes，the masking technique，and amplicon high－resolution melting analysis［J］.J Mol Diagn，2007，9（2）:184－196.

To establish the high resolution melting analysis with unlabeled probes for genotyping IL－15 gene SNPs＊

Wang Yue，Zheng Qicheng，Yao Xiuyun，Deng Bing，Xian Ying，Yu Jie△
（Department of Hematology－Oncology，the Affiliated Children＇s Hospital of Chongqing Medical University／the Key Laboratory of Child Development Disease Research of Education Ministry／the Key Laboratory of Paediatrics of Chongqing／Chongqing International Science and Technology Cooperation Base for Major Child Disease Development and Prevention，Chongqing400014，China）

ObjectiveWe were going to establish the high resolution melting analysis with unlabeled probes for genotyping IL－15gene SNP.MethodsGenotypes of the IL－15gene SNPs were determined in 80unrelated Han healthy children using High resolution melting curve analysis with unlabeled probes，small amplification method，genotype results were corroborated by gene sequencing.ResultsThe genotype result from unlabeled probes method and gene sequencing were consistent，the accuracy rate was 100%；small amplification method without temperature inter calibration could not differentiate the wild homozygous and mutant homozygous.ConclusionHigh resolution melting curve analysis with unlabeled probes is a cheap，convenient，fast and accurate genotype technology for known SNP sites.

interleukin－15；polymorphisms，single nucleotide；high resolution melting；unlabeled probes

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.001

A

1671－8348（2012）34－3577－03

國家“十一五”科技支撐計劃資助項目（2007BAI04B03）；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目基金資助項目（2011－2－208）。 △

，Tel:13906005672；E－mail:yujie167＠yahoo.com。

2012－07－02

2012－09－18）