神經肽Y對海馬神經元興奮性突觸活動的影響

董長征， 董秀芳， 趙文清， 張素芳， 李文玲

藥物難治性癲癇目前仍是臨床上治療的難題，神經肽Y(neuropeptide，NPY)基因治療癲癇逐漸成為國內外研究的熱點［1］，NPY全名神經肽酪氨酸，是由36個氨基酸組成的多肽。作為廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)的神經遞質，NPY被認為具有調節(jié)神經元興奮性的作用。在前期研究中我們已經證實了將NPY基因通過腺相關病毒載體轉移至大鼠海馬內實現(xiàn)過表達，4w后可以減輕致癇大鼠的發(fā)作程度［2］。但是NPY抑制癲癇發(fā)作的細胞分子學機制仍不十分清楚。

本研究應用全細胞膜片鉗技術，記錄原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經元的自發(fā)興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs)，分析NPY對海馬神經元突觸電活動的影響，探討NPY調控癲癇發(fā)作的細胞分子學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生24h Wistar大鼠若干只，由英國利茲大學生物系實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑及設備 Neurobasal TM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Trypsin)、L-多聚賴氨酸、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸購自GIBCO公司，氯化鎂(MgC12、6H2O)分析純購買自英國Fisher Scientific公司。AxonClamp 200B放大器、數(shù)轉換器(Digidata 1320A 16-bit Aequisition System)、BPS-8灌流控制系統(tǒng)均購自美國Axon公司;Olympus CK2倒置顯微鏡購自日本的Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元原代培養(yǎng) 首先75%乙醇消毒，快速斷頭取腦，在解剖顯微鏡輔助下，無菌分離大鼠雙側海馬組織，放置于冰浴的解剖液中，然后用0.125%的胰蛋白酶37℃培養(yǎng)箱消化15min，加入NM5培養(yǎng)基，中和胰酶終止消化。用手動單道可調式移液器輕輕吹打組織塊15次(不超過20次)，制作成單細胞懸液。用計數(shù)板進行細胞計數(shù)，用細胞培養(yǎng)液將細胞數(shù)調整為2～5×105/m l，然后將細胞分別接種于細胞培養(yǎng)皿中。將細胞放入5%CO2、37℃、95%濕度的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2～3h后用NM5培養(yǎng)基全量換液;3d后，用NM5培養(yǎng)基半量換液;自第6天起，用加入10μmol/L阿糖胞苷(Ara-C)NM1培養(yǎng)基半量換液。每天在倒置相差顯微鏡下觀察神經元生長狀況，包括細胞突起、形態(tài)、輪廓及細胞密度等。培養(yǎng)12d的細胞用于后續(xù)膜片鉗試驗。

1.2.2 神經元癲癇樣放電模型的建立 將培養(yǎng)12d的海馬神經元，用無鎂(Mg2+free)細胞外液處理3h，然后用正常細胞外液繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)膜片鉗試驗。采用EPC-10膜片鉗系統(tǒng)進行全細胞模式的電流鉗記錄神經元的動作電位，若出現(xiàn)自發(fā)的穩(wěn)定的癲癇樣異常放電形式，說明造模成功。

1.2.3 實驗分組 培養(yǎng)的神經元被分為4組:對照組，癲癇組(Mg2+free組)，0.1μmol NPY 組，1μmol NPY組。癲癇組只用無鎂細胞外液處理3h;0.1μmol NPY組，在神經元癲癇樣放電模型建立成功后，給予0.1μmol NPY 干預;1μmol NPY 組，在神經元癲癇樣放電模型建立成功后，給予0.1μmol NPY干預。

1.2.4 全細胞膜片鉗模式記錄各組海馬神經元的 sEPSCs。

1.2.4.1 標準全細胞膜片鉗模式記錄 將玻片上培養(yǎng)12d的神經元放入浴槽中，用預先配好的細胞外液持續(xù)灌流細胞，速度2ml/min。倒置顯微鏡(O-lympus CK2)下選擇胞體飽滿、遮光性強、輪廓清晰的錐體神經元進行封接。玻璃微電極入液的電阻值為6～8MΩ。在微操縱器(Model 285)輔助下將預先拉制好的玻璃微電極與神經元表面形成巨阻抗封接(giga-seal)，封接電阻達1GΩ以上并穩(wěn)定后繼續(xù)施加負壓擊破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成穩(wěn)定的全細胞記錄模式(whole-cell recording)。

1.2.4.2 電壓鉗模式下記錄海馬神經元的sEPSCs 記錄自發(fā)興奮性突觸后電流(sEPSCs)時，細胞膜電位鉗制在靜息電位-70mV，gap-free模式連續(xù)記錄。實驗在室溫(23℃ ～25℃)條件下進行。每組至少統(tǒng)計6例細胞數(shù)據(jù)。所有原始實驗數(shù)據(jù)由pClamp 9.0軟件采樣系統(tǒng)獲得，直接進入 Clamfit 9.0軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行測量、分析、作圖。

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經元的形態(tài)學觀察體外培養(yǎng)第12天的海馬神經元在倒置顯微鏡下觀察可見:細胞輪廓清晰，周圍有光暈，胞體飽滿、折光性良好，彼此間廣泛突觸聯(lián)系形成。選取形態(tài)一致的、多角形的、胞體飽滿的、周圍帶光暈發(fā)育良好神經元用于后續(xù)膜片鉗試驗。

2.2 NPY對各組海馬神經元sEPSCs的影響sEPSCs是在全細胞電壓鉗記錄下記錄到的細胞的一種自發(fā)性電活動，結果顯示:對照組神經元sEPSCs發(fā)放頻率為 1.296 ±0.241HZ，幅度為51.085 ±1.961pA;癲癇組神經元 sEPSCs發(fā)放頻率明顯增加至28.826±1.254HZ，統(tǒng)計學分析有顯著性差異(P ＜0.05);幅度52.759 ±2.384pA，與對照組相比無差異(P＞0.05)。NPY給藥10s后，通過全細胞電流鉗記錄，結果顯示0.1μmol NPY組sEPSCs的頻率為 0.895 ±0.146HZ;1μmol NPY 組頻率為0.461 ±0.394HZ，與癲癇組(28.826 ±1.254HZ)相比，均有明顯降低，統(tǒng)計學分析有顯著性差異(P＜0.05)。0.1μmol NPY 組的頻率降低的程度小于1μmol NPY組神經元，統(tǒng)計學分析有顯著性差異(P＜0.05)。sEPSCs幅度各組相比無明顯差異，結果(見表1)。

表1 各組神經元sEPSCs發(fā)放頻率及幅度的比較(±s)

表1 各組神經元sEPSCs發(fā)放頻率及幅度的比較(±s)

與對照組比較*P ＜0.05;與癲癇組比較#P ＜0.05;與0.1μmol NPY組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) sEPSCs發(fā)放頻率 sEPSCs幅度對照組癲癇組0.1μmol NPY 組1μmol NPY 組7988 1.296 ±0.241 28.826 ±1.254*0.895 ±0.146#0.461 ±0.394#△51.085 ±1.961 52.759 ±2.384 49.276 ±2.144 50.958 ±2.016

3 討論

藥物難治性癲癇由于其發(fā)病機制的復雜性，臨床治療非常棘手，常規(guī)的藥物治療和外科手術雖然能部分緩解癲癇發(fā)作癥狀，但是長期療效難以令人滿意。隨著分子生物學和基因技術的不斷發(fā)展，癲癇的基因治療逐漸引起人們的興趣，為臨床徹底治愈難治性癲癇帶來了新的希望［3］。在中樞神經系統(tǒng)廣泛存在的多肽-神經肽Y(NPY)，被認為具有抗癲癇和調節(jié)神經興奮性的強大作用。實驗性動物模型中，外源性NPY基因注射顱內后有明顯抑制癲癇大鼠發(fā)作的作用，Noe F［4］研究發(fā)現(xiàn)腺相關病毒介導的NPY基因轉染明顯減少了紅藻氨酸誘導的癲癇發(fā)作，而對大鼠的認知和記憶能力無明顯影響。國內董長征等研究表明:以腺相關病毒為載體，將NPY基因轉染至大鼠腦內，NPY明顯降低了慢性癲癇模型大鼠的發(fā)作程度［2］;并且可保護線粒體的功能，減輕癲癇引起的超微結構病理改變，從而發(fā)揮神經保護的作用［5］。癲癇發(fā)病機制是各種原因導致的大腦神經元異常同步化放電。既往研究NPY對癲癇發(fā)作的影響多集中在動物實驗水平，而在神經電生理水平，NPY對癲癇神經元電活動影響的研究較少，我們已經證實了NPY能夠降低癲癇神經元動作電位發(fā)放的頻率和波幅［6］，然而，NPY對癲癇神經元興奮性突觸后電流的研究尚未報道。

自從1976年德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann教授創(chuàng)建膜片鉗技術以來，此項技術近幾年來成為神經電生理研究的重要工具和實驗平臺，已被廣泛應用于神經電生理學研究領域中［7］。本研究運用全細胞膜片鉗模式檢測了NPY對海馬神經元自發(fā)興奮性突觸后電流的影響。結果顯示:無鎂細胞外液處理過的神經元可以很好地模擬體內癲癇神經元的狀態(tài)，sEPSCs的發(fā)放頻率較正常神經元明顯加快;而 0.1μmol和 1μmol NPY 組 sEPSCs的發(fā)放頻率較癲癇組明顯降低。4組sEPSCs的幅度比較無明顯差異。神經細胞膜電位的改變是神經細胞自身功能和細胞相互之間信號傳遞的生理基礎，當離子通道、神經遞質等改變時，可造成神經細胞膜內外正負電荷的異常流動，從而改變了神經元的興奮性。一般認為［8］:自發(fā)興奮性突觸后電流(sEPSCs)是神經細胞突觸前興奮性遞質釋放引起的突觸后電流，其頻率反映突觸前遞質的釋放概率，頻率的增高一般反映單位時間內谷氨酸釋放的數(shù)目增加，由突觸前因素決定。其幅度與突觸后膜受體活性有關，幅度的變化反映突觸后膜谷氨酸受體(AMPA或NMDA受體)的反應性或數(shù)目的變化，由突觸后因素決定。

本實驗以sEPSCs為觀察指標，檢測了NPY對大鼠海馬神經元谷氨酸釋放的影響。結果顯示:癲癇組sEPSCs的發(fā)放頻率較正常神經元明顯加快，0.1μmol和 1μmol NPY 可明顯降低癲癇神經元sEPSCs的產生頻率，但并不影響sEPSCs的幅度。而且，NPY對sEPSCs頻率的抑制具有濃度依賴性，濃度越高，抑制能力越強。在目前濃度下并沒有徹底抑制sEPSCs的發(fā)放?？赡芘c給藥的濃度和持續(xù)時間均有關系。根據(jù)經典神經電生理學理論對sEPSCs變化的分析，如果藥物對sEPSCs的幅度分布無作用，只是影響頻率，說明NPY對海馬癲癇神經元谷氨酸釋放的作用位點存在于神經突觸前膜。有研究顯示在培養(yǎng)的神經元中發(fā)現(xiàn)NPY能夠通過Y2受體抑制突觸前膜神經元的N型鈣離子流［9］，同時它也抑制海馬腦片培養(yǎng)中突觸前膜N-，P/Q-和其他類型的鈣離子流［10］，由此我們分析，鈣離子流減少將會阻止同一神經末梢谷氨酸的釋放，減少谷氨酸介導的自發(fā)興奮性突觸后電位，繼而阻斷后續(xù)的一系列級聯(lián)反應，從而避免神經細胞的興奮性損傷如神經元凋亡或壞死，最終發(fā)揮NPY抑制癲癇及其神經元保護劑的作用。本實驗從神經電生理水平證實了NPY具有強大的抗突觸興奮性和抗癲癇效果。結合我們前期的研究，證實NPY與癲癇之間的確存在著密切聯(lián)系，NPY很可能在抗癲癇的過程中發(fā)揮著重要作用，相信這一領域的研究為NPY基因治療癲癇應用到臨床提供更多的證據(jù)支持。

志謝:感謝英國利茲大學膜與系統(tǒng)生物實驗室江林華教授給予本研究的技術支持。

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