乳腺癌中的脂聯(lián)素受體1表達(dá)及其信號(hào)通路激活對(duì)癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究

鮑軼 鐘征翔 崔戈

乳腺癌中的脂聯(lián)素受體1表達(dá)及其信號(hào)通路激活對(duì)癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究

鮑軼 鐘征翔 崔戈

目的探討人能量代謝相關(guān)基因脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)在乳腺癌中的表達(dá)及其信號(hào)通路激活對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。方法采用已發(fā)表的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，分析AdipoR1在各病理亞型中的不同表達(dá)，以及AdipoR1基因表達(dá)與HER－2表達(dá)的相關(guān)性。采用免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)AdipoR1在MCF－7、MDA－MB－231和SKBR3等ER+、HER－2+及ER－癌細(xì)胞株中的表達(dá);采用Western blotting法檢測(cè)MCF－7細(xì)胞在脂聯(lián)素不同時(shí)間長(zhǎng)度的作用下，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白AMPK及S6激酶(S6K)的活化。結(jié)果AdipoR1在正常乳腺組織樣乳癌中基因表達(dá)最低，與其他各組病理亞型乳癌有顯著性差異(P＜0.05)。在乳腺癌中，AdipoR1基因表達(dá)與HER－2基因呈正相關(guān)(Pearson，r=0．134)。AdipoR1廣泛表達(dá)于ER+、HER－2+及ER－乳腺癌細(xì)胞系中。在低濃度(0．5μg/ml)脂聯(lián)素作用下，AMPK及mTOR的底物蛋白S6K在15min發(fā)生磷酸化活化，磷酸化信號(hào)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而加強(qiáng)，30min時(shí)信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高峰;之后開始下降，但在1h仍能檢測(cè)到磷酸化。結(jié)論AdipoR1基因表達(dá)水平在各乳腺癌病理亞型不同，該受體在各類乳腺癌細(xì)胞株中廣泛表達(dá)。乳腺癌中的脂聯(lián)素信號(hào)通路激活，可活化AMPK及mTOR信號(hào)通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝、蛋白合成及細(xì)胞增殖過(guò)程。

乳腺癌脂聯(lián)素受體1基因表達(dá)腺苷酸活化蛋白激酶S6激酶

本研究探討AdipoR1在乳腺癌中的表達(dá)，研究該基因在不同亞型的乳腺癌其分子表達(dá)水平的差異，及與乳腺癌周圍正常組織基因表達(dá)水平的差異。應(yīng)用與AdipoR1具有高度親和力的脂聯(lián)素，作用于體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7，研究其通過(guò)AdipoR1對(duì)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及mTOR信號(hào)通路的影響，探討脂聯(lián)素及其受體的信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

材料與方法

白的表達(dá)。收集各組細(xì)胞，制備總蛋白樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度;蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離，5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶1000)，4° C孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫下孵育雜交1h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

結(jié)果

1．AdipoR1在不同病理亞型的乳腺癌組織中基因表達(dá):分析Herschkowitz等在2007年發(fā)表的美國(guó)婦女乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)，提示AdipoR1在不同病理亞型各組的乳腺癌組織中基因表達(dá)有顯著差異，在normal－breast like中的表達(dá)量最低(P＜0．05) (圖1)。

1．主要材料:人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7、T47D、SKRB3、BT474和MDA－MB231購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);脂聯(lián)素購(gòu)自美國(guó)Biovision公司;DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購(gòu)自Gibco公司;AdipoR1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;pAMPK、tAMPK、pSK6、SK6抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;鼠抗人β－actin、tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;羊抗鼠IgG－HRP、兔抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research Laboratories，Inc。

2．基因表達(dá)數(shù)據(jù):基因表達(dá)數(shù)據(jù)(microarray data)從Herschkowitz等在2007年發(fā)表的文獻(xiàn)上獲得［5］。原實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自北卡羅來(lái)納大學(xué)(the University of North Carolina)新鮮組織樣本庫(kù)中女性乳腺癌患者癌組織。根據(jù)病理分子亞型的不同，基底樣(basal－like)乳腺癌66例，HER－2+/ER－36例，luminial A 66例，luminial B 35例，正常乳腺組織樣(normalbreast like)16例［6］。

3．細(xì)胞培養(yǎng):MCF－7、T47D、SKRB3、BT474和MDAMB231細(xì)胞培養(yǎng)于高糖型DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%滅活胎牛血清50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素，放置于5%CO237℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。應(yīng)用MCF－7癌細(xì)胞株，研究重組人脂聯(lián)素(recombinant adiponectin)作用于其受體后信號(hào)通路的激活對(duì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。在加入脂聯(lián)素的前1天晚上，MCF－7細(xì)胞在無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天在無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基中加入0．5μg/ml脂聯(lián)素，分別培養(yǎng)15min、30min及1h后收取細(xì)胞后做相應(yīng)檢測(cè)。

4．免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)蛋白表達(dá):Western blotting方法檢測(cè)AdipoR1、pAMPK、tAMPK、pS6K和S6K蛋

圖1 在Herschkowitz等在2007年發(fā)表的美國(guó)女性乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中分析AdipoR1 mRNA在不同乳腺癌不同病理亞型的表達(dá)(*P＜0．05)

2．AdipoR1和HER－2基因的表達(dá)呈正相關(guān):運(yùn)用Pearson相關(guān)系數(shù)，在Herschkowitz等在2007年發(fā)表的美國(guó)女性婦女乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中，AdipoR1和HER－2基因的表達(dá)的相關(guān)性。Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算的是兩變量互比比例，即線性相關(guān)程度，相關(guān)系數(shù)范圍在－1～1之間，－1表示完全負(fù)相關(guān)，1表示完全正相關(guān)，0表示不相關(guān)。經(jīng)計(jì)算，AdipoR1和HER－2基因的表達(dá)Pearson相關(guān)系數(shù)0．134，呈正相關(guān)(P＜0．05，圖2)。

3．AdipoR1在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá):應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)ER+、ER－和HER－2+的乳腺癌細(xì)胞株，包括MCF－7、T47D、SKRB3、BT474和MDA－231中AdipoR1蛋白的表達(dá)。微管蛋白(tubu-lin)表達(dá)作為內(nèi)參。經(jīng)檢測(cè)，AdipoR1蛋白信號(hào)在上述的癌細(xì)胞株中均有表達(dá)(圖3)。

圖2 使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析AdipoR1 mRNA與HER－2 mRNA之間的相關(guān)性(Pearson，r=0．134)

圖3 Western blotting法檢測(cè)AdipoR1蛋白癌細(xì)胞株中的表達(dá)tubulin作為內(nèi)參

4．脂聯(lián)素處理MCF－7不同時(shí)間后對(duì)pAMPK、pS6K蛋白表達(dá)及活性的影響:用低濃度脂聯(lián)素(0.5μg/ml)在不同的時(shí)間點(diǎn)(0、15、30min和1h)處理MCF－7細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)AMPK和S6K在脂聯(lián)素及其受體激活的過(guò)程中發(fā)生磷酸化過(guò)程。實(shí)驗(yàn)以AMPK和S6K磷酸化抗體為目的蛋白，以總AMPK、S6K蛋白抗體及β－肌動(dòng)蛋白(βactin)作為內(nèi)參蛋白。研究顯示在0min，MCF－7在無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，AMPK和S6K蛋白未見明顯磷酸化，基本處于本底水平，在加入脂聯(lián)素15min后即可發(fā)現(xiàn)AMPK和S6K產(chǎn)生磷酸化，30min達(dá)到高峰，1h仍然可見，但是較30min的磷酸化水平有所下降(圖4)。

討論

脂聯(lián)素及其受體在肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪酸氧化和葡萄糖代謝的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道顯示，脂聯(lián)素受體激活后作用于其下游的接頭蛋白，如含血小板－白細(xì)胞C激酶底物同源性/磷酸酪氨酸結(jié)合域和亮氨酸拉鏈基元1的接頭蛋白(adaptor protein containing pleckstrin homology，phosphotyrosine binding domain and leucine zipper motif 1，APPL1)，依次活化肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)和AMPK等激酶蛋白后發(fā)揮生理作用［7］。AMPK是細(xì)胞內(nèi)對(duì)能量代謝極為敏感的蛋白激酶，受細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP水平的調(diào)控［8］。目前研究認(rèn)為AMPK是脂聯(lián)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，其正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，控制體內(nèi)的血糖水平及增強(qiáng)胰島素敏感性，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗動(dòng)脈粥樣硬化起到重要作用［9］。

惡性腫瘤細(xì)胞常通過(guò)增加葡萄糖攝取和無(wú)氧糖酵解增加來(lái)維持其高增殖率。明確腫瘤細(xì)胞能量代謝機(jī)制可研發(fā)針對(duì)阻斷能量供應(yīng)的新型靶向治療策略，使腫瘤細(xì)胞處于“饑餓”狀態(tài)而凋亡。脂聯(lián)素信號(hào)系統(tǒng)是在肥胖及2型糖尿病中被廣泛關(guān)注和研究的通路。通過(guò)分析已發(fā)表的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)AdipoR1 mRNA表達(dá)水平在各組不同病理亞型的乳腺癌中存在著顯著的差異性，AdipoR1在正常乳腺組織樣乳腺癌中表達(dá)最低，并且通過(guò)對(duì)另一組在2005年公開發(fā)表的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行相同分析處理，我們亦發(fā)現(xiàn)AdipoR1的表達(dá)在腫瘤組織中較周圍正常的乳腺組織顯著增高(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這些研究發(fā)現(xiàn)還和文獻(xiàn)報(bào)道的AdipoR1在結(jié)直腸癌組織中較周圍正常組織高表達(dá)一致［10，4］。這些研究結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)提高AdipoR1的mRNA使其細(xì)胞表面該受體蛋白含量增加，并可能進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)糖類代謝。另外，在肥胖患者體內(nèi)脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素降低，其外周血循環(huán)脂聯(lián)素濃度下降，組織細(xì)胞特別是癌細(xì)胞可能通過(guò)某種未知的反饋性調(diào)節(jié)機(jī)制代償性的增強(qiáng)AdipoR1的表達(dá)。

另外，通過(guò)Herschkowitz等發(fā)表的基因芯片數(shù)據(jù)研究，我們還發(fā)現(xiàn)AdipoR1和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor－2，HER－ 2)基因的表達(dá)有著正相關(guān)。HER－2(亦稱C－erbB2)基因，其基因拷貝數(shù)在約30%乳腺癌患者中增加，并發(fā)現(xiàn)是與腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)的重要分子［11］。HER－2受其配體影響，在細(xì)胞表面形成二聚體而激活其下游信號(hào)通路，包括MAPK細(xì)胞增殖通路及PI3K/AKT細(xì)胞存活通路，HER－2和AdipoR1這兩個(gè)受體表達(dá)正相關(guān)可能都與腫瘤細(xì)胞不受調(diào)控的高增殖率及抵抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，但目前尚不清楚二者之間是否存在著直接聯(lián)系。

通過(guò)研究AdipoR1在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其mRNA在ER+的癌細(xì)胞系(MCF－7，T47D及BT474)、HER－2+的癌細(xì)胞系(SKBR3)以及ER－的癌細(xì)胞系(MDA－231)都有廣泛表達(dá)。另外我們發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以迅速影響MCF－7細(xì)胞內(nèi)的AMPK和mTOR下游的蛋白激酶S6K，其磷酸化提示PI3K/ AKT/mTOR信號(hào)通路激活。亦有報(bào)道提示應(yīng)用脂聯(lián)素可以抑制前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌及胃癌細(xì)胞的增殖［12～14］。由于PI3K/AKT/mTOR是癌細(xì)胞增殖的通路，我們考慮可能是在較生理濃度低的脂聯(lián)素作用下，MCF－7細(xì)胞通過(guò)AdipoR1的活化，可激活mTOR信號(hào)通路從而影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成。但對(duì)于脂聯(lián)素是如何激活mTOR信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，mTOR信號(hào)通路激活可增加P21蛋白水平，該分子是調(diào)控細(xì)胞分裂周期的關(guān)鍵之一，所以AdipoR1通路激活后是否影響了P21蛋白的表達(dá)也需進(jìn)一步研究。另外，AdipoR1在乳腺癌細(xì)胞中活化是否發(fā)揮類似在肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中影響GLUT4等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用而提高癌細(xì)胞的葡萄糖攝入，也需要深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AdipoR1基因表達(dá)水平在各乳腺癌病理亞型中有差異，在正常組織樣乳腺癌中表達(dá)最低。AdipoR1蛋白廣泛表達(dá)于ER+、ER－及HER－2+的乳腺癌中。另外，在低濃度的脂聯(lián)素作用下，可以激活乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的AMPK及S6K等激酶，影響腫瘤細(xì)胞能量代謝及細(xì)胞增殖。

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(收稿:2012－01－05)

(修回:2012－02－16)

Expression of Adiponectin R1 and its Signaling Pathway In Breast Cancer．

Bao Yi，Zhong Zhengxiang，Cui Ge．Jiaxing Second Hospital，Zhejiang 314000，China

ObjectiveTo investigate the energy metabolism－related gene adiponectin receptor 1(AdipoR1)in breast cancer and the effects of its signaling pathway activation on breast cancer cells．MethodsUsing the published gene expression data set in database，the different gene expression of AdipoR1 were analyzed in various subtypes of breast cancer，and AdipoR1 gene expression is positively correlated with and HER－2 expression．Western blotting was used to examine the AdipoR1 protein expression in ER+，HER－2+and ER－cell lines，including MCF－7，MDA－MB－231 and SKBR3．After MCF－7 cells were exposed in the media with recombinant adiponectin in varieties of time points，the activity of AMPK kinase and S6 kinase were also examined．ResultsThe gene expression of AdipoR1 was significantly low in normal breast－like breast cancer comparing with other pathological subtypes(P＜0．05)．AdipoR1 gene expression was positively correlated with HER－2 gene in breast cancer(Pearson r=0．134)．AdipoR1 was widely expressed in ER+，HER－2+and ER－breast cancer cell lines．In addition，the administration of 0．5μg/ml of adiponectin to MCF－7 cells，AMPK and S6 kinase were rapidly phosphorylated in 15min and further increased in 30min，but declined in 1h．ConclusionThere was difference in the mRNA level of AdipoR1 in a varieties of subtypes of breast tumor tissue，and widely expressed both in ER+，HER－2+and ER－breast cancer．In tumor cells，the activation of adiponectin and its receptor signaling pathway could influence energy metabolism，protein synthesis and cell proliferation through activation of AMPK and mTOR pathway．

Breast cancer;Adiponectin receptor 1;Gene expression;AMP－activated protein kinase;S6 kinase

脂聯(lián)素(adiponectin)是一種由脂肪細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)之一，近年來(lái)被廣泛研究。外周血脂聯(lián)素水平與肥胖、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤等相關(guān)［1］。2003年，Yamauchi等［2］發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了兩類脂聯(lián)素受體的存在，分別為AdipoR1和AdipoR2，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其廣泛分布和表達(dá)于人體許多組織細(xì)胞表面，其中AdipoR1主要表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞，對(duì)脂聯(lián)素的球狀結(jié)構(gòu)域具有高親和力，但對(duì)全長(zhǎng)脂聯(lián)素親和力低;而AdipoR2主要表達(dá)在肝細(xì)胞，對(duì)兩者具有中等親和力。AdipoR1和AdipoR2是包含了7個(gè)穿膜區(qū)域的G蛋白，但其N末端位于細(xì)胞內(nèi)，而C末端位于細(xì)胞外，因而結(jié)構(gòu)上異于傳統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)受體［2］。脂聯(lián)素與其細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)、p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)分子激活，傳遞脂聯(lián)素的信息，與肥胖患者在糖尿病中的胰島素抵抗有密切的關(guān)系。最近有研究顯示，肥胖患者血清脂聯(lián)素水平降低還與乳腺、結(jié)腸、及前列腺組織的癌變有關(guān)［3］。最近在對(duì)結(jié)直腸癌患者脂聯(lián)素受體表達(dá)的研究中，Williams等［4］發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中脂聯(lián)素受體表達(dá)較周圍正常組織顯著增加，提示脂聯(lián)素受體信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的能量代謝有可能相關(guān)。

國(guó)家自然青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101707);浙江省中醫(yī)藥基金資助項(xiàng)目(2011ZA104)

314000浙江省嘉興市第二醫(yī)院

鮑軼，電子信箱:ybao2011@gmail．com