轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β激活激酶1在NF－κB信號(hào)通路中的作用及臨床意義

邵天偉 梁小明 陳昌輝

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一。MAPK鏈由3類蛋白激酶(MAP3KMAP2K－MAPK)組成。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β激活激酶1(transforming growth factor－βactivated kinase－1，TAK1)是MAP3K家族的主要成員，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，是NF－κB信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，在炎癥基因表達(dá)中起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用［1］。TAK1作為通路中的上游信號(hào)分子，可以使IκB激酶(IκB kinase，IKK)磷酸化，活化NF－κB，觸發(fā)下游的NF－κB級(jí)聯(lián)反應(yīng)［2］。

NF－κB信號(hào)通路在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，且在多種病理生理過(guò)程(包括炎癥、免疫、細(xì)胞凋亡等)中發(fā)揮作用［3～5］;NF－κB的異?；罨c多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)?，F(xiàn)就TAK1激活NF－κB信號(hào)通路的研究進(jìn)展及臨床意義進(jìn)行闡述。

一、TAK 1的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)作用

1.TAK1的結(jié)構(gòu):TAK1為單跨膜蛋白，具有保守的激酶活性域、疏水性強(qiáng)的N端跨越類囊體膜，處于基質(zhì)中的親水性C端結(jié)構(gòu)。TAK1蛋白含有9個(gè)α－螺旋和18個(gè)β－折疊，無(wú)規(guī)卷曲約占57%，在第168～190位點(diǎn)存在一個(gè)ATP結(jié)合域，第162～440位點(diǎn)為激酶功能域。TAK1 激酶活性區(qū)是VVHRDIKSSNILL(285～297)，具有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的特點(diǎn)，第289位的天冬氨酸(Asp，D)是激活絲氨酸－蘇氨酸羥基的催化殘基，即活性位點(diǎn)［6］。TAK1是NF－κB經(jīng)典信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)蛋白，其激活NF－κB的磷酸化位點(diǎn)為蘇氨酸(Thr)－184位和Thr－187位［7］。

2.TAK1的生物學(xué)作用:TAK1在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。Vidal等［9］研究dTAK1基因突變的果蠅時(shí)發(fā)現(xiàn)，TAK1基因突變的果蠅雖然能夠生存和繁殖，但其產(chǎn)生抗菌肽的能力消失，對(duì)革蘭陰性菌高度易感。表明TAK1在固有免疫介導(dǎo)NF－κB信號(hào)通路中具有重要作用。促炎因子(如TNF和 IL－1β)主要誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)［10］。Map3k7基因負(fù)責(zé)編碼TAK1的激酶結(jié)構(gòu)的一部分，包括ATP的催化位點(diǎn)(Lys63)。Takaesu等［2］通過(guò)RNA干擾使Hela細(xì)胞中的TAK1(Lys63)基因位點(diǎn)突變，再用IL－1β和TNF刺激Hela細(xì)胞，Hela細(xì)胞的NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)則不能被激活。Sato等［8］通過(guò)雜交建立 Map3k7基因缺陷小鼠模型，用于研究TAK1在體內(nèi)外的功能，發(fā)現(xiàn)雜交得到的Map3k7－/－基因型的小鼠在子宮內(nèi)即已死亡。從胚胎期死亡的Map3k7－/－小鼠的胚芽中分離出小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，再用TNF及IL－1β刺激TAK1缺陷的MEFs，這種細(xì)胞的TAK1由于缺乏ATP結(jié)合位點(diǎn)而喪失功能，MEFs的NF－κB信號(hào)通路則不能被激活。表明TAK1在IL－1β和TNF誘導(dǎo)的NF－κB和JNK激活及細(xì)胞因子的產(chǎn)生過(guò)程中是必需的。進(jìn)一步研究顯示，TAK1缺乏的B細(xì)胞存在NF－κB基因及NF－κB靶基因表達(dá)缺陷;當(dāng)B細(xì)胞受到脂多糖(LPS)和磷酸胞苷酰(CpG)等刺激時(shí)，JNK和NF－κB通路不能被激活。說(shuō)明在激活B細(xì)胞受體(B－cell receptor，BCR)介導(dǎo)的信號(hào)通路中也需要TAK1參與。當(dāng)刺激TAK1基因缺陷的B細(xì)胞時(shí)，除IgM以外，其他血清免疫球蛋白表達(dá)都減少。Sato等［11］隨后在構(gòu)建的T細(xì)胞TAK1基因缺陷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TAK1在T細(xì)胞受體(T－cell receptor，TCR)介導(dǎo)NF－κB活化及MAPKs活化、T細(xì)胞成熟、T細(xì)胞增殖中都起著關(guān)鍵性的作用。研究顯示，應(yīng)用TAK1的抑制劑能夠明顯抑制T細(xì)胞分泌IL－2［12］，表明TAK1作為一種激酶，可以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。由此可見(jiàn)，TAK1在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。

二、TAK 1在激活NF－κB信號(hào)通路中的作用

沒(méi)有外界刺激時(shí)，NF－κB雜二聚體與其抑制蛋白IκB位于細(xì)胞質(zhì)中，呈無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)各種刺激因子(如脂多糖、病毒蛋白、氧自由基、細(xì)胞因子等)刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)物質(zhì)聚集，多種蛋白激酶被磷酸化，進(jìn)而將刺激信號(hào)傳遞給TAK1;活化的TAK1能夠使IKKβ的絲氨酸(Ser)－177和Ser－181位磷酸化并激活I(lǐng)κB激酶(IκB kinase，IKK)復(fù)合物，促進(jìn)IκB蛋白降解，去除IκB的抑制作用后，NF－κB才能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［13，14］。TAK1可經(jīng)多種途徑激活NF－κB信號(hào)通路。

1.TAK1經(jīng)腫瘤壞死因子受體(TNFR)激活NF－κB信號(hào)通路:免疫細(xì)胞受TNF－α刺激時(shí)，首先配體與TNFR結(jié)合，招募死亡區(qū)腫瘤壞死因子受體1相關(guān)蛋白(TNF receptor 1 associated via death domain，TRADD)、腫瘤壞死因子相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor－associated factor，TRAF2)、腫瘤壞死因子相關(guān)因子5(TRAF5)及受體相互作用蛋白1(receptor－interacting protein 1，RIP1)等受體相關(guān)復(fù)合物，再由賴氨酸63偶聯(lián)的多聚泛素鏈(Lys63－linked polyubiquitination)使TRAF2和RIP1泛素化(ubiquitination)，最后 RIP1與 BC13/UEV1A泛素活化酶(ubiquitin－activating enzyme，E1)催化聚泛素化復(fù)合蛋白體生成。聚泛素化復(fù)合蛋白體則能夠通過(guò)泛素蛋白結(jié)合TAB2/TAB3與NEMO(IKK的基本調(diào)節(jié)亞單位［由IKKr亞單位和IKK激酶組成］)。NEMO亞單位招募TAK1和IKK，二者結(jié)合后IKK被TAK1活化，進(jìn)而使NF－κB活化［15］。在新生鼠缺氧性腦損傷動(dòng)物模型中，當(dāng)TNF－R1表達(dá)增多時(shí)，可加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡;TNF－R2表達(dá)增多時(shí)，TAK1表達(dá)也增多，則促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生，對(duì)腦損傷的恢復(fù)起促進(jìn)作用。Nijboer等［16］研究表明，在腦損傷發(fā)病及其過(guò)程恢復(fù)中TAK1表達(dá)均增加。

2.TAK1經(jīng)IL－1R/TLR激活NF－κB信號(hào)通路:IL－1β或LPS分別與各自的受體IL－1R、TLR結(jié)合，進(jìn)而賴氨酸63偶聯(lián)的多聚泛素鏈TRAF6與白介素－1受體相關(guān)激酶家族(IRAKs)結(jié)合，再募集髓樣分化因子 88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，使IRAK1與IRAK4結(jié)合，IRAK4可磷酸化并激活I(lǐng)RAK1，磷酸化的IRAK1結(jié)合并活化TRAF6，然后TRAF6與UBC13/UEV1A E1一起催化聚泛素化復(fù)合蛋白體的生成，經(jīng)與TNFR同樣的方式連接TAB2/TAB3與NEMO，激活TAK1［17～19］，最后TAK1活化NF－κB和AP－1，從而調(diào)節(jié)多種效應(yīng)基因的表達(dá)(如炎癥因子、化學(xué)增活素、黏附分子和蛋白水解酶)［20］。骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中TAK1 mRNA表達(dá)量與正常人相比明顯減少，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與TAK1的減少相關(guān)。用 IL－1β孵育人軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞株時(shí)，TAK1蛋白表達(dá)減少，間質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1、MMP13及TNFa的表達(dá)也減少。表明TAK1與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

3.TAK1經(jīng)BCR/TCR激活NF－κB信號(hào)通路:除上述兩種途徑外，刺激BCR/TCR也可經(jīng)賴氨酸63偶聯(lián)的多聚泛素鏈?zhǔn)筎RAF2和TRAF6泛素化，以相似的方式激活B細(xì)胞及T細(xì)胞中的NF－κB。蛋白激酶C(protein kinase PKC，PKC)屬于絲氨酸－蘇氨酸激酶(serine－threonine kinase);PKCβ和PKCθ分別在BCR和TCR通路中起作用。最初，結(jié)合了配體的BCR/TCR復(fù)合體會(huì)啟動(dòng)酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活PKCβ/θ。然后，PKCβ/θ激酶能誘導(dǎo)半胱天冬氨酸募集區(qū)域膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白1－淋巴瘤凋亡抑制基因10－黏膜相關(guān)淋巴瘤異位基因1(CARMA1－Bcl10－MALT1，CBM)復(fù)合體的形成。CBM復(fù)合體中的MALT1蛋白含有能與TRAF2和TRAF6結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能將TRAF6招募至CBM復(fù)合體，通過(guò)促進(jìn)TRAF6的寡聚化作用激活泛素－蛋白連接酶3 (ubiquitin－protein ligatillg enzymes，E3s)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種TRAF6蛋白的靶蛋白(如BCL10、MALT1、NEMO以及TRAF6蛋白自身)。最后，在BCR/TCR信號(hào)刺激作用下，這些靶蛋白經(jīng)多泛素化修飾后都有可能被招募并激活TAK1－IKK復(fù)合體。Sato等［11］研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞Tak1基因缺陷鼠出生后前3個(gè)月是正常的，4～6個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉。腹瀉小鼠有結(jié)腸僵硬、結(jié)腸脫垂、脾大等現(xiàn)象。組織學(xué)研究顯示，這些小鼠的結(jié)腸出現(xiàn)潰瘍、上皮層杯狀細(xì)胞消失及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。無(wú)TAK1基因缺陷的對(duì)照組小鼠則無(wú)此現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TAK1基因缺陷小鼠胸腺中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目缺失。因而推測(cè)通過(guò)對(duì)TAK1進(jìn)行干預(yù)，增加調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的數(shù)目，將能預(yù)防TAK1缺陷引起的自發(fā)性結(jié)腸炎。

三、TAK1與疾病的關(guān)系

1.感染性疾病與TAK1:臨床上，新生兒易患感染性疾病。固有免疫在新生兒免疫防御中發(fā)揮重要作用。由于未經(jīng)過(guò)抗原刺激，新生兒的適應(yīng)性免疫細(xì)胞缺乏記憶，尚不成熟，處于暫時(shí)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能低下?tīng)顟B(tài)，有待以后發(fā)育完善。所以，新生兒患嚴(yán)重的病毒感染和真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)較高;體內(nèi)使細(xì)菌感染局限化的能力較弱，感染容易全身擴(kuò)散。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞特異性缺乏TAK1會(huì)影響CD4+和CD8+SP胸腺細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致外周血、淋巴結(jié)和脾臟等周?chē)M織中的T細(xì)胞明顯減少。推測(cè)TAK1與新生個(gè)體的固有免疫與適應(yīng)性免疫的發(fā)育密切相關(guān)。TAK1的表達(dá)缺陷可能導(dǎo)致在新生兒期對(duì)病原體感染無(wú)應(yīng)答。同時(shí)，適應(yīng)性免疫在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中也不能建立完善。研究表明，TAK1基因突變的果蠅固有免疫功能受損［9］;TAK1缺乏小鼠的細(xì)胞免疫及體液免疫受損［8，11］。福氏志賀菌Ⅲ型能夠分泌具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性的效應(yīng)因子OspF。OspF可以使受感染上皮細(xì)胞的MAPKs p38不可逆地脫磷酸化，抑制p38的表達(dá)。p38能負(fù)反饋調(diào)節(jié)TAK1的表達(dá)。感染福氏志賀菌Ⅲ型的小鼠上皮細(xì)胞p38表達(dá)減少，使TAK1無(wú)限制被活化，導(dǎo)致NF－κB信號(hào)通路過(guò)度激活。NF－κB的激活會(huì)使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，對(duì)感染產(chǎn)生應(yīng)答。但NF－κB無(wú)限制地被激活，會(huì)使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，也可能使炎癥細(xì)胞凋亡，或使免疫細(xì)胞處于功能的沉默狀態(tài)，從而影響機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的局限能力。

許多感染性疾病對(duì)機(jī)體造成損害的機(jī)制與TAK1上調(diào)炎癥反應(yīng)基因有關(guān)。流感嗜血桿菌(nontypeable hemophilus influenzae，NTHi)是兒童和成人的常見(jiàn)病原體之一。NTHi容易引起兒童中耳炎，是導(dǎo)致傳導(dǎo)性耳聾的重要原因。感染NTHi后，TAK1表達(dá)增多，IKKβ的激活被上調(diào)，IKKβ加速I(mǎi)KBa的分解，IKBa的減少造成NF－κB過(guò)度活化，分泌的IL－1β、IL－8、TNF等炎性因子增多，導(dǎo)致中耳內(nèi)皮細(xì)胞受損;增多的炎性因子又可進(jìn)一步激活NF－κB，使炎癥反應(yīng)被放大。呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰兒及兒童流行性呼吸道疾病的常見(jiàn)致病病原體。RSV感染呼吸道上皮細(xì)胞，引起免疫及炎癥反應(yīng)。抑制TAK1可以減少RSV感染引起的炎癥反應(yīng)，減輕對(duì)機(jī)體造成的損傷。適當(dāng)調(diào)節(jié)TAK1的表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)，機(jī)體既能對(duì)感染產(chǎn)生應(yīng)答，又不造成免疫過(guò)強(qiáng)性損傷。

2.缺氧性腦損傷與TAK1:研究表明，炎癥在大腦的局部缺血性損傷中起著重要的作用。嚙齒類動(dòng)物缺氧1h后，缺氧區(qū)域TNF－αmRNA表達(dá)增多;缺氧2～6h后，TNF－α蛋白即有表達(dá)。TNF－α及促凝素可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞加重腦再灌注損傷。新生鼠缺氧缺血性腦病模型的腦組織有暫時(shí)性IL－1βmRNA和TNF－αmRNA的表達(dá)增多。IL－1β、TNF－α等致炎因子增加可通過(guò)上述3種途徑來(lái)激活TAK1，使NF－κB通路活化，造成神經(jīng)酰胺的積聚，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。當(dāng)缺氧時(shí)，新生大鼠腦組織TAK1表達(dá)增多，NF－κB被激活，TNFa mRNA及蛋白量表達(dá)增多;當(dāng)TAK1分解增多時(shí)，NF－κB被抑制，腦損傷減輕。在用神經(jīng)保護(hù)性藥物TAT－NBD對(duì)腦損傷進(jìn)行治療時(shí)，疾病恢復(fù)過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞TAK1總量及磷酸化TAK1表達(dá)都增加。表明TAK1通過(guò)激活NF－κB參與了缺氧性損傷;同時(shí)TAK1也參與了腦神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)過(guò)程，但具體機(jī)制仍不清楚，可能與TAK1激活了另外的通路有關(guān)［16］。研究發(fā)現(xiàn)，用TAK1的抑制劑處理缺氧腦細(xì)胞1h，能減少缺氧引起的腦細(xì)胞的凋亡;用抑制劑腦室內(nèi)注射20min，可以減少中腦動(dòng)脈閉塞引起的腦梗死的面積，并使小鼠腦損傷后的右旋轉(zhuǎn)的行為消失。說(shuō)明短時(shí)間抑制TAK1可以減少腦細(xì)胞死亡，改善感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，對(duì)腦損傷起到保護(hù)作用。進(jìn)一步研究表明，長(zhǎng)時(shí)間抑制TAK1并不能對(duì)腦損傷起到保護(hù)作用，原因是延長(zhǎng)對(duì)TAK1抑制的時(shí)間，則可激活細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1，對(duì)抗TAK1的抑制作用。

3.針對(duì)TAK1的靶向治療:針對(duì)TAK1的靶向治療，為炎癥性損傷的治療提出了新思路。靶向基因治療是指當(dāng)雙鏈RNA被特異的核酸酶降解時(shí)，產(chǎn)生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，可使特異性酶降解靶RNA，從而抑制或下調(diào)靶基因的表達(dá)。經(jīng)siRNA誘導(dǎo)的小鼠，出生后3周脾臟TAK1表達(dá)明顯降低，NF－κB依賴的信號(hào)通路受到抑制，炎癥反應(yīng)減弱;關(guān)節(jié)炎小鼠模型經(jīng)siRNA治療后，全身癥狀得到有效緩解;siRNA處理的小鼠CD4+♂T細(xì)胞數(shù)目減少;脾細(xì)胞在接受抗原或抗CD3/CD28抗體刺激時(shí)，產(chǎn)生TNF－α、干擾素 －γ (IFN－γ)和白介素－17A(IL－17A)等炎性因子的能力降低。說(shuō)明靶向抑制TAK1基因可起到免疫調(diào)節(jié)的作用。化學(xué)性抑制劑5Z－7－oxozeaenol通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制TAK1的ATP結(jié)合位點(diǎn)，可以在體內(nèi)外選擇性抑制TAK1的活性。應(yīng)用5Z－7－oxozeaenol與細(xì)胞共同孵育5～10min，可明顯減少內(nèi)源性TAK1的生成;加大劑量至100nmol/L處理30min，清除5Z－7－oxozeaenol，抑制作用仍將持續(xù)，提示大劑量、長(zhǎng)時(shí)間其對(duì)細(xì)胞的抑制作用是不可逆的。為了進(jìn)一步證明5Z－7－oxozeaenol的體內(nèi)作用，采用化學(xué)藥物2，4，6－三硝基氯苯等使小鼠耳部致敏，建立環(huán)氧化酶2介導(dǎo)的炎性腫脹模型，測(cè)量耳的厚度作為觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示，給小鼠耳部應(yīng)用5Z－7－oxozeaenol后，可以有效緩解其耳部腫脹癥狀達(dá)50%。5Z－7－oxozeaenol也可以減少缺氧性腦損傷引起的腦細(xì)胞凋亡，緩解小鼠腦損傷的癥狀。表明TAK1表達(dá)增多導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng)并造成機(jī)體損傷時(shí)，靶向抑制TAK1可以減少炎癥因子的釋放，起到保護(hù)機(jī)體的作用。

綜上所述，TAK1在NF－κB信號(hào)通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，參與了多種疾病的發(fā)病過(guò)程。通過(guò)上調(diào)或抑制TAK1，可激活或阻斷NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到增強(qiáng)免疫應(yīng)答或減少機(jī)體炎性損傷的作用。但對(duì)TAK1的干預(yù)時(shí)間及程度仍需進(jìn)一步研究。

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