高壓氧對慢性疲勞綜合征大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

孟祥恩 張 禹 楊 晨 張敦曉 欒翔凌 潘曉雯

第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院 海軍總醫(yī)院高壓氧科，北京 100048

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一組全身性綜合征，主要為長期嚴(yán)重疲勞造成，以新發(fā)生的、持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的虛弱性疲勞為其基本特征，持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月，普通休息不能令其好轉(zhuǎn)，而在體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查方面未發(fā)現(xiàn)異常指標(biāo)?；颊咭坏┗加蠧FS，工作能力、效率及日常生活將受到嚴(yán)重影響，而在當(dāng)今社會(huì)，“過勞死”這一嚴(yán)重的社會(huì)問題是隨著疾病的發(fā)展所導(dǎo)致最嚴(yán)重后果[1]。據(jù)報(bào)道[2]在美國每年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到90 億美元，這是患CFS降低生產(chǎn)力所致。目前社會(huì)特點(diǎn)為生活節(jié)奏快，社會(huì)競爭激烈，這就使得人們?nèi)菀桩a(chǎn)生精神和身體的疲勞，長此以往，這種疲勞愈發(fā)嚴(yán)重，這就使得該病的患者逐漸增多，與此同時(shí)原來只有在高年齡才會(huì)發(fā)生的高血壓、冠心病等慢性疾病愈發(fā)的年輕化，甚至有30歲出頭就并發(fā)生高血壓腦血管及心血管意外的病例，這給個(gè)人及整個(gè)家庭帶來嚴(yán)重的損害，而龐大的醫(yī)療及護(hù)理費(fèi)用將給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前CFS的確切發(fā)病機(jī)制及病因還未明確，但隨著慢性疲勞綜合證大鼠動(dòng)物模型被建立并被不斷完善，通過對于模型不斷的研究，筆者對該病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)組織器官的病理、生理變化，有了更加深入的認(rèn)識，尤其在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，不光進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的研究，更重要的是可以通過模型試驗(yàn)各種可能的治療方法，將理論應(yīng)用于實(shí)踐，該病的治療研究方面將得到積極發(fā)展。高壓氧通常被認(rèn)為是一種特殊環(huán)境下的物理治療方式，其廣泛被接受的治療機(jī)制為增加全身血氧分壓、氧含量和組織內(nèi)氧氣的儲備量，從而達(dá)到維持缺血缺氧組織的新陳代謝，使全身內(nèi)環(huán)境得到平衡。而隨著高氣壓醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，高壓氧的其他治療機(jī)制越來越多地被發(fā)現(xiàn)，其中有多項(xiàng)報(bào)道指出，高壓氧治療對于急性運(yùn)動(dòng)疲勞有確切的療效[4-5]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者用SD大鼠通過力負(fù)重竭游泳的方法建立慢性疲勞綜合征的動(dòng)物模型，重點(diǎn)觀察慢性疲勞綜合征大鼠血管內(nèi)皮功能的變化，即血漿內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（nitric oxide，NO）及血管性假血友病因子（von wille-brand Factor，vWF）三方面的影響，以及經(jīng)過高壓氧治療以上3個(gè)指標(biāo)的變化，從而更深入地研究CFS的發(fā)病機(jī)制，特別是對心血管造成的影響，以及高壓氧在治療該病方面的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物選擇 雄性健康SD大鼠50只，清潔級，體重230～260 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京維通利華動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供[許可證編號SCXK（京）200720001]。飼養(yǎng)動(dòng)物的環(huán)境：實(shí)驗(yàn)室清潔飼養(yǎng)，溫度21～26℃，濕度50%左右，噪聲 <60 dB，工作照明：12 h明12 h暗。

1.1.2 儀器 大鼠實(shí)驗(yàn)泳缸（本實(shí)驗(yàn)室自制）；開闊箱（本實(shí)驗(yàn)室自制）；爬桿架；電子秤；單人純氧艙。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組將50只SD大鼠每5只一籠，使其自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為5 組，每組10只大鼠。各組處理如下，①空白對照組：無需任何處理，在適宜環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)；②高壓氧對照組：SD大鼠無需任何處理，僅在實(shí)驗(yàn)第15 天給予高壓氧治療5次；③CFS模型組：僅給予力竭游泳進(jìn)行動(dòng)物模型制造；④CFS高壓氧組：給予力竭游泳進(jìn)行動(dòng)物模型制造，造模成功后給予高壓氧治療5次；⑤CFS休息組：給予力竭游泳進(jìn)行動(dòng)物模型制造，造模成功后給予單純休息5d。

1.2.2 制備CFS模型將5只SD大鼠單籠飼養(yǎng)，讓大鼠在基礎(chǔ)進(jìn)食 （每只SD大鼠于安靜狀態(tài)下的進(jìn)食量大約為大鼠體重的5%）的條件下力竭游泳，連續(xù)游泳訓(xùn)練14 d。具體方法：將SD大鼠放在裝滿26℃左右水溫的游泳缸（60 cm×40 cm×100 cm）中進(jìn)行負(fù)重的游泳，以每只大鼠各自體重的5%為負(fù)重量標(biāo)準(zhǔn)，采用1日2次的游泳方法，2次游泳間隔10 min，直到游泳至完全力竭。然后從水中將大鼠撈出后，熱風(fēng)機(jī)將動(dòng)物皮毛吹干。力竭的標(biāo)準(zhǔn)：SD大鼠肢體游泳動(dòng)作特別失調(diào)、慌張，泳缸內(nèi)游泳的范圍逐漸縮小，基本不會(huì)大范圍游動(dòng)，僅在泳缸的一處勉強(qiáng)維持自己浮于水面；鼻尖部頻繁在水面上下浮動(dòng)，頭部完全沒入水面下10 s不能浮出為力竭的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 高壓氧治療 單人純氧艙，洗艙時(shí)間30 min，壓力2.0 ATA，加壓時(shí)間5min，穩(wěn)壓60 min，減壓時(shí)間5min，連續(xù)5d。

1.2.4 標(biāo)本制備及檢測 空白對照組和CFS模型組在模型制備成功后（即實(shí)驗(yàn)第14 天），立即用水合氯醛腹腔注射將兩組大鼠全麻，打開胸腔直視下經(jīng)心腔取血，放置后將部分血清送交南京建成生物工程研究所，采用放射免疫法分別檢測ET-1、NO及vWF水平。CFS高壓氧組、CFS休息組及高壓氧對照組動(dòng)物于CFS高壓氧組、高壓氧對照組高壓氧治療5次后（即實(shí)驗(yàn)第19 天）立即用水合氯醛腹腔注射將3 組大鼠全麻，打開胸腔直視下經(jīng)心腔取血，放置后將部分血清送交南京建成生物工程研究所采用放射免疫法分別檢測ET-1、NO及vWF水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析，組間比較應(yīng)用LSD-t及SNK-q法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白對照組比較，CFS模型組血清vWF、ET-1 值明顯上升，血清NO值明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；CFS高壓氧組血清vWF、ET-1 明顯升高， 血清NO明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與高壓氧對照組比較，CFS模型組及CFS高壓氧組，上述指標(biāo)也有同樣的變化趨勢（P<0.01 或P<0.05）。與CFS模型組比較，CFS高壓氧組血清vWF、ET-1 顯著降低，NO顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P<0.05）；CFS休息組與以上指標(biāo)無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。與CFS高壓氧組比較，CFS休息組血清ET-1、vWF明顯上升，NO明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。以上結(jié)果指出高壓氧治療對慢性疲勞綜合征大鼠有積極的治療作用，進(jìn)一步證明了單純休息不能使該病得到緩解。見表1。

表1 不同組別之間ET-1、NO 及vWF比較（±s，n=10）

表1 不同組別之間ET-1、NO 及vWF比較（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高壓氧對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 CFS 模型組比較，&P<0.05；與 CFS 高壓氧組比較，△P ＜0.05

組別 血管性假血友病因子（ng/mL）一氧化氮（μmol/L）血漿內(nèi)皮素-1（ng/mL）空白對照組高壓氧對照組CFS模型組CFS高壓氧組CFS休息組3.88±0.40 4.19±0.42 6.16±0.36**#5.02.±0.31*#&6.03±0.40**△25.59±3.12 26.74±1.50 16.13±1.93**##20.24±2.31*#&15.41±1.79**△54.96±4.92 55.83±3.63 68.32±3.57**#60.04±5.69*#&65.52±4.54**△

3 討論

本研究顯示，ET-1、vWF值在CFS模型組大鼠較正常對照組明顯升高，相反，NO值明顯下降，這是CFS大鼠血管內(nèi)皮功能受損或血管內(nèi)皮功能功能發(fā)生紊亂的間接體現(xiàn)，在國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道中此類變化多被提及[5]。從解剖上，血管內(nèi)皮是覆蓋在血管腔內(nèi)表面的一類單層扁平細(xì)胞，在局部具有調(diào)節(jié)與營養(yǎng)細(xì)胞間聯(lián)系的功能，另外，其特殊的內(nèi)分泌功能越來越受到重視并被廣泛關(guān)注，國內(nèi)外相關(guān)研究提示，血管內(nèi)皮細(xì)胞能分泌大量的血管活性物質(zhì)，如纖維蛋白溶解酶原激活物抑制物（PAI）、vWF和ET-1 等；而血管內(nèi)皮細(xì)胞不但是分泌細(xì)胞，它還存在許多受體，能與許多活性物質(zhì)相結(jié)合，具有調(diào)節(jié)血管舒張狀態(tài)、維持凝血和纖溶系統(tǒng)的平衡、抑制血小板聚集、抑制炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附以及調(diào)控血管平滑肌生長等重要功能，同時(shí)，在調(diào)節(jié)血液循環(huán)、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境方面也起著重要作用。而血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損害或功能紊亂后，其釋放的各種血管活性物質(zhì)的量就會(huì)發(fā)生改變，從而使原本正常的比例失調(diào)，試驗(yàn)表明，這種血管活性物質(zhì)釋放的比例失調(diào)與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[6]。

ET-1 主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放的一類較強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，是由21個(gè)氨基酸殘基組成的血管活性多肽，存在3個(gè)同分異構(gòu)體，均有較強(qiáng)縮血管作用[7]。ET-1 能與血管平滑肌纖維中Na+/Ca2+和Na+/H+交換受體相結(jié)合，通過離子交換使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度升高，血管平滑肌纖維收縮，從而產(chǎn)生持續(xù)、強(qiáng)烈的縮血管作用[8]，是一種內(nèi)源性損傷因子，可引起相關(guān)組織的缺血、缺氧。ET-1 受體主要分布于心血管系統(tǒng)，其濃度持續(xù)維持在高位可導(dǎo)致心肌細(xì)胞供血的血管持續(xù)收縮，從而發(fā)生心肌細(xì)胞的假性肥大，隨著病理生理的逐漸發(fā)展將導(dǎo)致心室壁重塑即向心性心肌肥厚，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致心臟泵血功能明顯下降，從而導(dǎo)致心功能衰竭的發(fā)生并危及患者生命[9]，特別是一旦發(fā)生心室重塑，將長期影響患者的生活質(zhì)量。NO又稱內(nèi)皮源性舒張因子，能使可溶性鳥苷酸環(huán)化酶被激活，從而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，進(jìn)而引起血管平滑肌松弛、血管擴(kuò)張和外周阻力下降，作為一種舒血管物質(zhì)，對內(nèi)皮素具有生理拮抗作用[10]，它們釋放的比例關(guān)系更影響到血管舒張狀態(tài)的調(diào)節(jié)；另外，抗血小板凝集、抗血栓形成和抑制血小板與其他細(xì)胞之間的黏附等作用也是NO的主要作用。ET-1 和NO是兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的主要的血管活性物質(zhì)，兩者作用相反，前者為最強(qiáng)的縮血管因子，而后者是強(qiáng)效舒血管因子。通過調(diào)控NO和ET-1的釋放比例，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以使血管和血流變達(dá)到平衡，大多數(shù)心腦血管疾病的發(fā)生被認(rèn)為是這種平衡被打破從而造成功能紊亂的結(jié)果，如高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與ET-1 與NO比值失調(diào)與冠心病有著密切聯(lián)系。

vWF是一種大分子糖蛋白，由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生，是血小板糖蛋白在血管內(nèi)皮上的配體，是血管內(nèi)皮特有的因子，除一部分分泌到循環(huán)中和內(nèi)皮下組織外，其余的儲存在棒管狀小體中。vWF的主要生理功能包括調(diào)節(jié)血小板黏附、促進(jìn)血栓的形成、攜帶血漿因子、穩(wěn)定其活性等。當(dāng)正常生理情況下血管受到損傷時(shí)，棒管狀小體將vWF釋放入血[8]，從而促進(jìn)血小板黏附，血栓形成，在修復(fù)血管的過程中發(fā)揮其積極作用，而過度vWF釋放，將導(dǎo)致包括血小板黏附障礙等一系列不良反應(yīng)，從而引起血管內(nèi)皮損傷或功能紊亂。有實(shí)驗(yàn)提出，血漿vWF水平在高血壓患者中顯著升高，而通過治療血壓控制較好的患者，vWF水平又會(huì)降到正常，這說明解除血管收縮狀態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)將得到緩解。實(shí)驗(yàn)研究指出在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損時(shí)，vWF作為血管內(nèi)皮分泌的活性物質(zhì)，其數(shù)值的變化是十分敏感的指標(biāo)[11]，有學(xué)者認(rèn)為，vWF是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要標(biāo)志物[12]。

本研究提示相對于CFS模型組，CFS高壓氧組的ET-1、vWF降低明顯；NO明顯升高，說明高壓氧這種治療方法對CFS大鼠受損或紊亂的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的恢復(fù)有積極的治療作用。高壓氧治療普遍的機(jī)制為大大提高了物理溶解在血中的氧分壓，從而提高血液中血氧含量、氧儲量及血氧彌散距離，使遠(yuǎn)端缺氧、受損區(qū)域快速得到改善；而近年研究表明，高壓氧除了增加患者的血氧分壓，還有調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、調(diào)整人體內(nèi)分泌平衡以及改善血流動(dòng)力學(xué)等方面的作用。高春錦等[13]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CO中毒大鼠血管內(nèi)皮功能受到損傷，而高壓氧治療能改善其血管內(nèi)皮功能，使升高的ET-1 及降低的NO逐漸恢復(fù)正常。高壓氧還可通過降低血小板聚集、清除老化紅細(xì)胞等作用降低血液黏滯度，從而改善血液流變學(xué)，進(jìn)而達(dá)到改善動(dòng)脈血液循環(huán)的作用；高壓氧治療還能通過降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)的鈣超載的情況得到糾正，部分對抗ET-1 引起鈣超載導(dǎo)致的縮血管作用，以達(dá)到緩解血管平滑肌痙攣、收縮，使血管內(nèi)皮細(xì)胞得到修復(fù)及從而改善其功能。同時(shí)，高壓氧治療可以通過緩解血管平滑肌的痙攣、收縮改善內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有氧代謝，使長期受損的內(nèi)皮細(xì)胞得到修復(fù)，達(dá)到逐漸恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的目的[7]。

但相對于空白對照組，CFS高壓氧組在以上3項(xiàng)指標(biāo)上仍有一定差距，即ET-1、vWF仍較高，NO水平較低，考慮為以下3個(gè)因素導(dǎo)致：①對于受損或功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞高壓氧治療只能有部分積極作用，單純高壓氧治療不能達(dá)到治愈的目的，可能還需聯(lián)合應(yīng)用其他治療方式，才能完全治愈；②僅給予慢性疲勞綜合征大鼠高壓氧治療5次，對于這一發(fā)病過程漫長的疾病來說，單次治療時(shí)間及總療程可能相對較短，還未能完全發(fā)揮高壓氧治療的積極作用；③本次試驗(yàn)高壓氧治療所采用的壓力，為目前臨床普遍的治療壓力，對于CFS是否合適，提高或降低一些壓力能否使療效更好，有待進(jìn)一步研究。另外，空白對照組與高壓氧對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明高壓氧對于正常健康SD大鼠血管內(nèi)皮功能無影響，這從血清ET-1、vWF及NO水平可間接體現(xiàn)，這也從側(cè)面反映高壓氧治療的安全性。

綜上所述，心、腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展均與血管內(nèi)皮功能障礙有密切的聯(lián)系，其病理生理過程越來越被人們所認(rèn)識。目前，血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是是導(dǎo)致心肌梗死及腦血管意外發(fā)生的主要原因，長期過度的工作疲勞、生活的壓力過大、不科學(xué)的生活方式和不正確的飲食習(xí)慣，很可能導(dǎo)致慢性疲勞綜合征的發(fā)生，它已成為導(dǎo)致血管內(nèi)皮損害的兇手之一，常此以往必將促成心腦血管意外的發(fā)生。然而，CFS如何誘發(fā)血管內(nèi)皮功能紊亂，其發(fā)生的具體機(jī)制仍未能被發(fā)現(xiàn)，還需要進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究來揭示這一機(jī)制，這將是十分漫長的過程。然而，更重要的是，在尋找慢性疲勞綜合征導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)生機(jī)制的同時(shí)，能夠找到減少、延緩或治療血管內(nèi)皮功能障礙進(jìn)展的方法有著更加現(xiàn)實(shí)的臨床意義。高壓氧治療對CFS大鼠血管內(nèi)皮功能障礙有明顯的恢復(fù)作用，且對于正常大鼠無明顯副作用，為進(jìn)一步安全地應(yīng)用于臨床提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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