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    蛹蟲草菌株發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌活性初探

    2012-09-12 00:55:44韓燕峰張延威董旋黃玉梁宗琦
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年16期
    關(guān)鍵詞:抑菌檢測(cè)方法發(fā)酵液

    韓燕峰 張延威 董旋 黃玉 梁宗琦

    摘要:研究蛹蟲草(Cordyceps militaris)的發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果,為蛹蟲草抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。采用濾紙柱、海綿柱和花泥柱3種方法檢測(cè)其抑菌效果,結(jié)果表明蛹蟲草發(fā)酵液及菌絲提取物對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有一定抑制作用,其中菌絲提取物抑菌作用較強(qiáng);對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制。抑菌效果檢測(cè)方法以濾紙柱法檢測(cè)效果較好,花泥柱法次之,海綿柱法較差。

    關(guān)鍵詞:蛹蟲草;抑菌;檢測(cè)方法;發(fā)酵液;菌絲提取物

    中圖分類號(hào):S567.35;Q939.96文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)16-3492-04

    Studies on Antibacterial Activities of Fermentation Broth and Mycelia Extraction of Cordyceps militaris

    HAN Yan-feng1,ZHANG Yan-Wei2,DONG Xuan1,HUANG Yu1,LIANG Zong-qi1

    (1.Institute of Fungus Resources, College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025,China;

    2. Academy of Chemistry and Life Science, Guizhou Normal College, Guiyang 550018,China)

    Abstract: Fermentation broth and mycelia extraction of Cordyceps militaris in different fermentative days were explored for their antibacterial activities. For the three methods to test the antibacterial effect, the results showed that filter paper method was the best, followed by flower mud column, the worst was sponge column. The inhibition effect of mycelia extraction on both bacteria was stronger than that of fermentation broth; and the inhibition effect of both materials on Escherichia coli was stronger than that on Staphylococcus aureus.

    Key words: Cordyceps militaris; antibacterial; test method; fermentation broth; mycelia extraction

    蛹蟲草又名北冬蟲夏草,是我國(guó)名貴中藥材冬蟲夏草的代用品,含有多種生物活性物質(zhì)[1,2]。蛹蟲草為蟲、菌結(jié)合體,其真菌也常被稱為蛹蟲草(Cordyceps militaris)。研究發(fā)現(xiàn),蛹蟲草的子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中均有多種活性成分,能抑制部分細(xì)菌和真菌,對(duì)人體具有一定的保健功效,具有潛在應(yīng)用前景[3-5]。一些關(guān)于蛹蟲草的研究認(rèn)為,蛹蟲草的抗菌成分可能是蟲草素[6,7]、多糖[8]、多肽[9]、酶類[10]或酚類[11],具有抑菌作用可能是單一成分導(dǎo)致也有可能是多組分協(xié)同作用。劉陽(yáng)等[12]報(bào)道發(fā)酵液的抑菌效果是單一活性成分抑菌效果的2倍,表明蛹蟲草中多種活性成分共同作用的抑菌效果好于單一活性成分的抑菌效果。但針對(duì)某一種微生物而言,其主要抑菌活性物質(zhì)應(yīng)該是一類或一種物質(zhì)。

    試驗(yàn)采用3種檢測(cè)材料對(duì)蛹蟲草菌絲提取物和發(fā)酵液進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)比較,和常用的抑菌效果檢測(cè)采用的濾紙片法和牛津杯法有所不同。同時(shí)比較不同發(fā)酵天數(shù)的蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果,以期為蛹蟲草抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

    1材料與方法

    1.1供試菌株

    蛹蟲草GZUIFR-ZH菌株、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為貴州大學(xué)真菌資源研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2培養(yǎng)基

    PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g去皮切塊,煮沸30 min后6層紗布過濾,加入葡萄糖、瓊脂各20 g,水1 000 mL。121 ℃滅菌30 min。

    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g去皮切塊,煮沸30 min后6層紗布過濾,加入葡萄糖20 g,水1 000 mL,分裝至250 mL三角瓶中,每瓶裝液100 mL。121 ℃滅菌30 min。

    牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH 7.0~7.2。121 ℃滅菌30 min。

    細(xì)菌培養(yǎng)液:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,水1 000 mL,pH 7.0~7.2。121 ℃滅菌30 min。

    1.3試驗(yàn)方法

    1.3.1母液培養(yǎng)與發(fā)酵蛹蟲草菌種活化后,從PDA斜面試管中挑取適當(dāng)大小的菌塊,接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,170 r/min 25 ℃搖床培養(yǎng),待母液孢子數(shù)達(dá)到106個(gè)/mL時(shí)用移液槍吸取母液轉(zhuǎn)接至新的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量每瓶1 mL,170 r/min 25 ℃搖床培養(yǎng),液體發(fā)酵培養(yǎng)周期為10 d。

    1.3.2抑菌材料制作濾紙柱:?。磸埗ㄐ詾V紙為一疊,用打孔器打孔得到直徑為6 mm的濾紙片,壓平后分裝入潔凈的培養(yǎng)皿中,121 ℃滅菌30 min,放入烘箱烘干,使用時(shí)5疊濾紙片為一組(即一個(gè)濾紙柱由20張濾紙片組成)。

    海綿柱:取規(guī)整、質(zhì)地均勻的海綿塊(購(gòu)自超市),用打孔器打孔得到直徑為8 mm、高7 mm的海綿柱,分裝入潔凈的培養(yǎng)皿,121 ℃滅菌30 min,放入烘箱烘干。

    花泥柱:取無損、質(zhì)地均勻的花泥塊(購(gòu)自花店),用打孔器打孔得到直徑為7 mm、高7 mm的花泥柱,分裝入潔凈的培養(yǎng)皿,121 ℃滅菌30 min,放入烘箱烘干。

    1.3.3菌絲提取液制備準(zhǔn)確稱?。埃保?g烘干后的菌絲,放于1.5 mL蒸餾水中,于超聲波振蕩儀中提取30 min。

    1.3.4細(xì)菌菌懸液制備供試菌種活化后,從斜面培養(yǎng)基刮下部分菌體,接種于細(xì)菌培養(yǎng)液中,37 ℃培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)后的菌液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以細(xì)菌培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度至106個(gè)/mL,制成細(xì)菌菌懸液。

    1.3.5瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)試驗(yàn)

    1)取已滅菌的干凈培養(yǎng)皿,每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約20 mL的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,靜置待其凝透,取水平無冷凝水的平板使用。用移液槍移?。保担?μL細(xì)菌菌懸液添加到平板,涂布均勻,靜置30 min待菌液吸收。

    2)用移液槍移取培養(yǎng)1~10 d的發(fā)酵液或菌絲提取液100 μL分別加到已滅菌干燥的濾紙柱、海綿柱及花泥柱上,再將其移入平板中如圖1的相應(yīng)位置,每個(gè)平板每種材料設(shè)對(duì)照1個(gè)、供試液1個(gè),共6個(gè),3種材料間隔放置,各材料間距離相等。3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵液的空白對(duì)照為蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基,菌絲提取物的空白對(duì)照為蒸餾水。

    3)將上述平板移入冰箱中靜置,待液體充分浸漬到培養(yǎng)基后37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察記錄抑菌圈大小,十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,取其平均值。

    2結(jié)果與分析

    2.1蛹蟲草發(fā)酵液的抑菌效果

    含發(fā)酵液的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表1、圖2。由表1、圖2可見,海綿柱法未能檢測(cè)到抑菌效果,而采用濾紙柱和花泥柱的僅培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液出現(xiàn)抑菌效果,且對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。說明在試驗(yàn)中培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液抑菌物質(zhì)含量最高,而其余時(shí)間可能是因?yàn)橐志镔|(zhì)含量低未能檢測(cè)到抑菌效果。

    2.2蛹蟲草菌絲提取物的抑菌效果

    含菌絲提取物的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表2、圖3。由表2、圖3可見,培養(yǎng)4 d后的菌絲提取物在濾紙柱法和花泥柱法檢測(cè)中出現(xiàn)抑菌效果,且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加,菌絲提取物的抑菌作用增強(qiáng)。培養(yǎng)9 d的菌絲提取物在海綿柱法檢測(cè)中表現(xiàn)出抑菌效果,抑菌圈較前兩種方法小。同時(shí)可看出菌絲提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

    在試驗(yàn)條件下3種材料用于抑菌檢測(cè)的效果為:濾紙柱效果最佳,花泥柱次之,海綿柱最差。

    2.3菌絲提取物和發(fā)酵液抑菌效果比較

    對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明,只有培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液檢測(cè)出抑菌效果,而從培養(yǎng)4 d開始菌絲提取物表現(xiàn)出抑菌作用,且抑菌作用隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)。比較表1和表2數(shù)據(jù),可見蛹蟲草菌絲提取物的抑菌效果強(qiáng)于發(fā)酵液的抑菌效果。

    3小結(jié)與討論

    1)試驗(yàn)中為保證使用的3種材料測(cè)定的抑菌效果具有可比性,以濾紙柱所能吸收的最大加液量為限,設(shè)計(jì)加液量為100 μL,但實(shí)際使用中海綿柱及花泥柱可吸收的最大加液量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于100 μL,故可能存在花泥柱與海綿柱因加液量不足未能表現(xiàn)出應(yīng)有的檢測(cè)效果。在試驗(yàn)操作方面,累加5疊濾紙片需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間,容易導(dǎo)致細(xì)菌污染,移動(dòng)及擺放存在一定難度;海綿柱因無法主動(dòng)吸水,需要擠壓才能將液體吸入,操作麻煩,也存在較大被污染的可能性;花泥柱可主動(dòng)吸收液體,拿取容易,擺放方便,較前兩者更為方便。綜合考慮吸液量大小與操作簡(jiǎn)便性,推測(cè)使用花泥柱只要方法恰當(dāng),就能達(dá)到較好的檢測(cè)效果,具體情況有待下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

    2)試驗(yàn)中的發(fā)酵液具有抑菌效果,這與武忠偉等[4]的報(bào)道一致。陳宏偉等[8]報(bào)道蟲草多糖具有較強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)11.3 mm,本試驗(yàn)采用超聲波法提取的菌絲提取物的抑菌活性也較強(qiáng),培養(yǎng)10 d其對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到12.50 mm。由于試驗(yàn)采用的是粗提液,發(fā)酵液的抑菌成分和菌絲提取物的抑菌成分的確定還有待進(jìn)一步研究。

    3)從試驗(yàn)結(jié)果可見,濾紙柱在檢測(cè)蛹蟲草培養(yǎng)物的抑菌效果中表現(xiàn)較好,花泥柱次之,海綿柱較差;蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物均有抑菌作用,總體上對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制;菌絲提取物的抑菌作用強(qiáng)于發(fā)酵液。

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