鈦膠正相高效液相色譜法同時分析三聚氰胺和三聚氰酸

李 曼，李 榮，譚 津，姜子濤

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

鈦膠正相高效液相色譜法同時分析三聚氰胺和三聚氰酸

李 曼，李 榮，譚 津，姜子濤*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134）

建立了同時分析液態(tài)奶、自來水和游泳池水中三聚氰胺和三聚氰酸的鈦膠正相高效液相色譜法。色譜條件：分離柱為Titania Sachtopore-NP柱（250mm×4.6mm×5μm），流動相為水∶甲醇=50∶50（V/V）、流動相中含醋酸鹽1.0mmol/L、pH7.0、流速0.8mL/min、柱溫60℃、UV檢測波長210nm。 三聚氰胺和三聚氰酸分別在0.1～10μg/mL和2～100μg/mL范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為0.02μg/mL和0.1μg/mL，本方法三聚氰胺的回收率為94.8%～111.7%，三聚氰酸回收率為103.9%～114.3%，三聚氰胺和三聚氰酸測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.62%和0.78%（n=8）。

三聚氰胺，三聚氰酸，鈦膠柱，高效液相色譜法

Abstract：A method for simultaneous determination of melamine（MLM） and cyanuric acid（CA） in liquid milk，tap-water and swimming pool water by high performance liquid chromatography on normal-phase（NP） titania was devoloped.The samples were separated with a Titania Sachtopore-NP column（250mm×4.6mm×5μm）.The chromatographic separation conditions were as follows：a mixture of water and methanol in the ratio of 50 to 50（V/V） containing 1.0mmol/L acetate at pH7.0 was used as mobile phase，flow rate was 0.8mL/min，column temperature was 60℃，and the detection wavelength was 210nm.Calibration curves for MLM and CA exhibited good linearity over the concentration range from 0.1 to 10μg/mL for MLM and from 2 to 100μg/mL for CA.The limits of detection（LOD） of MLM and CA were 0.02μg/mL and 0.1μg/mL，respectively.The recoveries of the method ranged from 94.8%to 111.7%for MLM and from 103.9%to 114.3%for CA，and the relative standard deviations（RSDs） for MLM and CA were 0.62%and 0.78%，respectively.

Key words：melamine；cyanuric acid；titania-based stationary phase；high performance liquid chromatography

近幾年食品安全問題引起了全世界的關(guān)注。其中最為典型、影響最大的當屬三聚氰胺相關(guān)事件。三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，常被用作化工原料。因為其含氮量高，有些人將其作為偽蛋白添加到食品中，雖有研究證據(jù)顯示單獨攝入少量的三聚氰胺毒性較低[1]，但它在人體內(nèi)會逐步水解成其結(jié)構(gòu)類似物三聚氰酸，二者共存則會導(dǎo)致腎結(jié)石[2]。因為兩者共存時，會通過氫鍵作用生成穩(wěn)定且難溶于水的大分子復(fù)合物[3]。國外已有在乳制品中檢出三聚氰酸的報道[4]。三聚氰酸作為消毒液的原料之一可以降低氯的釋放速度，延長殺菌時間[5]。因此，開展三聚氰胺和三聚氰酸分析方法的研究具有很大的實際應(yīng)用價值。近年來，單獨測定三聚氰胺或三聚氰酸的研究較多，并且已有湖水和游泳池水中三聚氰酸檢測方面的報導(dǎo)[6]。但是同時分析三聚氰胺和三聚氰酸的文獻較少，主要的分析方法是高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-10]、酶聯(lián)免疫法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]。本文將新型HPLC固定相用于三聚氰胺和三聚氰酸的同時測定。鈦膠基質(zhì)固定相是近年發(fā)展起來的新型色譜填料，其具有傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)固定相不可比擬的優(yōu)點，不存在硅膠固定相對堿性化合物存在“不可逆吸附”的致命缺陷。并且鈦膠具有極好的化學(xué)穩(wěn)定性，在pH1～14的范圍內(nèi)都是非常穩(wěn)定的，可以彌補硅膠固定相的不足。在現(xiàn)在的研究中，我們應(yīng)用鈦膠基質(zhì)固定相正相柱，建立了鈦膠正相HPLC法同時測定三聚氰胺和三聚氰酸含量的新方法，并獲得較高的靈敏度、精密度和準確度，結(jié)果滿意。為食品的安全檢測提供了一個新途徑，同時也為拓展鈦膠固定相在食品分析中的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；無水醋酸銨 天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司，分析純；冰乙酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；氨水 天津市石英鐘廠，分析純；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；液態(tài)奶 購于天津商業(yè)大學(xué)某超市；三聚氰酸標準品 上海遠帆助劑廠，分析純，配制成100μg/mL標準貯備液：稱取10mg三聚氰酸置于100mL容量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定容至刻度，貯備液在2～8℃冷藏保存；三聚氰胺標準品 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純，配制成50μg/mL標準貯備液：稱取5mg三聚氰胺置于100mL容量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定容至刻度，貯備液在2～8℃冷藏保存；自來水 采自天津商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)實驗室；游泳池水 采自天津商業(yè)大學(xué)游泳館。

Agilent 1200系列高效液相色譜儀 配有單泵（型號G1310A），單可變波長紫外檢測器（型號G1314B），手動進樣器（型號G1328B），20μL定量環(huán)，柱溫箱（Yamatake HT-230A），安捷倫公司；鈦膠基質(zhì)正相色譜柱（Sachtopore-NP，5μm，250mm×4.6mm i.d.） 美國Zirchrom公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 色譜條件

流動相為水∶甲醇=50∶50（V/V），pH7.0，乙酸銨濃度為1.0mmol/L，流速為0.8mL/min，柱溫為60℃，UV檢測器波長210nm。以保留時間定性、峰面積定量。

1.3 標準曲線的繪制

1.3.1 三聚氰酸標準曲線的繪制 取100μg/mL的標準貯備液，稀釋為2、5、10、25和50μg/mL，進樣體積20μL，以三聚氰酸濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線并計算線性回歸方程。

1.3.2 三聚氰胺標準曲線的繪制 取50μg/mL的標準貯備液，稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10μg/mL，進樣體積20μL，以三聚氰胺濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線并計算線性回歸方程。

1.4 樣品前處理

1.4.1 液態(tài)奶的前處理 取1.0mL液態(tài)奶于15mL帶刻度塑料離心管中，加入20g/L的醋酸鉛0.5mL和5.0mL乙腈，用娃哈哈純凈水定容至10mL，超聲30min后，3000r/min離心10min，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾。

1.4.2 游泳池水和自來水 取5mL樣品用甲醇定容至10mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣，進樣體積20μL。根據(jù)三聚氰胺和三聚氰酸色譜峰面積，通過回歸方程計算得到樣液中三聚氰酸和三聚氰酸的含量（μg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相中醋酸鹽濃度的選擇

首先選定柱溫60℃、流速0.8mL/min、甲醇占流動相比例為50%和pH7.0，分別選取醋酸鹽的濃度為0.1、0.5、1.0、5.0和10mmol/L對三聚氰胺和三聚氰酸進行分析。結(jié)果顯示，隨著醋酸鹽的增加三聚氰酸的保留時間和半峰寬呈現(xiàn)增大的趨勢，有文獻報道隨著醋酸鹽濃度的增加鈦膠柱表面的水層變厚[14]，根據(jù)分配機理三聚氰酸更多的分配在水相中，所以其保留時間增加。三聚氰胺則相反，隨著醋酸鹽的增加三聚氰胺的保留逐漸變?nèi)酰@可能是因為三聚氰胺與鈦膠柱之間還存在著更強的吸附作用，而醋酸鹽與鈦膠柱之間的配體交換作用會抑制三聚氰胺與固定相的作用，所以隨著鹽濃度的增加三聚氰胺與鈦膠柱的接觸機率減小，其保留減弱。由于在高醋酸鹽濃度下三聚氰胺保留時間太弱，而低醋酸鹽濃度下二者分離度不高，為了將兩者更好的分離，最終選擇醋酸鹽濃度為1.0mmol/L。

圖1 保留時間和半峰寬與醋酸鹽濃度的關(guān)系Fig.1 Relations between retention time，peak width at half height and the concentration of sodium acetate in mobile phase

2.2 流動相pH的選擇

在柱溫60℃、流速0.8mL/min、甲醇占流動相體積比例50%和醋酸鹽濃度1.0mmol/L的條件下，通過加入醋酸和氨水來調(diào)節(jié)流動相的pH，分別為9.0、8.0、7.0、6.0和5.0用于三聚氰胺和三聚氰酸的分離分析。對于三聚氰酸來說，隨著pH的增加三聚氰酸分子中羥基氫的解離增強，分子極性增強，在正相柱上保留時間理應(yīng)增大，而有結(jié)果顯示當pH大于7.0時三聚氰酸隨著pH的增加保留時間反而減小，這可能是因為pH大于7時鈦膠柱表面帶負電，與三聚氰酸發(fā)生靜電排斥。對于三聚氰胺，結(jié)果顯示總體上隨著pH的增加保留時間顯示出逐漸減小的趨勢，這可能是由于三聚氰胺分子中氨基的質(zhì)子化隨pH增大（氫離子濃度減?。┒鴾p弱，即極性減弱，且鈦膠與電負性物質(zhì)的吸附作用隨著pH增大也逐漸減弱。綜合考慮保留時間與峰型（隨著pH減小，倒峰的干擾致使三聚氰酸的峰型變差），最終選擇流動相的pH為7.0。

圖2 保留時間和半峰寬與pH關(guān)系Fig.2 Relations between peak width at half height，retention time and pH

2.3 流動相中甲醇含量的選擇

在柱溫60℃、流速0.8mL/min、pH7.0和鹽濃度1.0mmol/L的條件下，改變甲醇和水的比例分離分析三聚氰胺和三聚氰酸，甲醇的含量分別為70%、60%、50%、40%和30%。隨著甲醇含量的增加三聚氰胺和三聚氰酸的保留時間也增加。三聚氰酸和三聚氰胺均為極性物質(zhì)，隨著甲醇比例的增加、水含量減少，流動相的極性逐漸減弱，根據(jù)相似相容原理所以二者的保留時間增大。在甲醇含量為40%和50%時柱效相對較高，但是當甲醇為40%時三聚氰胺的保留相對較弱，所以最終選擇甲醇含量為50%。分析物在正相鈦膠柱上的保留可能有兩種作用機理[15]：分配作用和吸附作用。當符合公式（1）時，柱子與分析物之間是分配作用，其中k是保留因子，φ是流動相中強洗脫劑占流動相的體積比例。當符合公式（2）時，柱子與分析物之間是吸附作用，其中k是保留因子，NB是流動相中強洗脫劑的摩爾百分含量。將三聚氰胺和三聚氰酸的數(shù)據(jù)代入，結(jié)果顯示用公式（1）和（2）做線性擬和均有比較好的線性，說明它們與柱子間既有分配作用又有吸附作用，但是隨著條件的改變兩種作用的強度也會發(fā)生變換。從二者隨醋酸鹽濃度的變化結(jié)果來看，三聚氰酸在正相鈦膠柱上的保留更傾向于分配機理，而三聚氰胺與鈦膠柱的作用以吸附作用更強。

圖3 保留時間和柱效與甲醇含量的關(guān)系Fig.3 Relations between retention time，number of plates and the proportion of methanol

2.4 流動相流速的選擇

在柱溫60℃、鹽濃度1.0mmol/L、pH7.0和甲醇占流動相體積50%條件下調(diào)節(jié)流速分別為1.0、0.9、0.8、0.7和0.6mL/min。隨著流速的增加分析物的保留時間也增加，半峰寬減小，但是柱壓逐漸增大，綜合考慮柱壓與分析時間最終選擇流速為0.8mL/min。

圖4 保留時間和半峰寬與流速的關(guān)系Fig.4 Relations between retention time，peak width at half height and flow rate

2.5 柱溫的選擇

在鹽濃度1.0mmol/L、pH7.0、甲醇含量50%和流速0.8mL/min的條件下，改變柱溫分別為30、40、50和60℃，對分析物三聚氰胺和三聚氰酸的分離分析影響不大，考慮到高溫下柱壓較低所以最終選擇溫度為60℃。

圖5 保留時間和柱效與柱溫的關(guān)系Fig.5 Relations between peak width at half height，retention time and number of plates

通過上述實驗因素條件的考察，最終確定三聚氰酸和三聚氰胺分離分析最佳條件為：流動相為水∶甲醇=50∶50、醋酸鹽1.0mmol/L、pH7.0、柱溫60℃、流速0.8mL/min、檢測波長210nm，三聚氰胺（1μg/mL）和三聚氰酸（10μg/mL）標準品的色譜圖如下，在該條件下分離度達7.24。

圖6 三聚氰胺和三聚氰酸標準品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of melamine and cyanuric acid standard samples

2.6 檢出限及線性范圍

2.6.1 三聚氰酸的檢出限及線性范圍 將三聚氰酸標準儲備液分別稀釋成2、5、10、25、50和100μg/mL的濃度進樣，考察了此方法的線性范圍。當三聚氰酸濃度在2～100μg/mL范圍內(nèi)，標準曲線線性良好，線性回歸方程為y=-19.0563+17.1396x，R=0.9994，檢出限（以3倍噪聲計算）為0.1μg/mL。

2.6.2 三聚氰胺的檢出限及線性范圍 將三聚氰酸標準儲備液分別稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10μg/mL的濃度進樣，考察了此方法的線性范圍。當三聚氰酸濃度在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)，標準曲線線性良好，線性回歸方程為y=12.1886+377.2558x，R=0.9999，檢出限（以3倍噪聲計算）為0.02μg/mL。

2.7 方法精密度和準確度

在選定的準確度的色譜條件下，用三聚氰胺（1.0μg/mL）和三聚氰酸（10μg/mL）的標準溶液重復(fù)進樣8次，計算得三聚氰胺和三聚氰酸的相對標準偏差即精密度分別為0.62%和0.78%。經(jīng)測定后自來水與游泳池水樣品中分析物樣的濃度在檢出限以下，在樣品中加入一定量三聚氰胺和三聚氰酸的混合標準溶液，與樣品一致處理后進樣測定方法回收率見表1，加標后樣品色譜圖見圖7。液態(tài)奶中由于本身基質(zhì)較復(fù)雜，在本實驗不采取固相萃取柱凈化等復(fù)雜前處理條件的情況下，在三聚氰胺吸收峰處有干擾物質(zhì)，所以需進行更有效的樣品前處理以減少系統(tǒng)峰的影響從而可以實現(xiàn)三聚氰胺的定性與定量。不過三聚氰酸可以與鄰近峰實現(xiàn)較好的分離，其與鄰近峰的分離度為1.82。綜上三種樣品的測定結(jié)果，本法三聚氰胺的回收率范圍是94.8%～111.7%，平均回收率為101.5%。三聚氰酸的回收率范圍是103.9%～114.3%，平均回收率為110.0%。

圖7 加標后樣品色譜圖Fig.7Chromatograms of（a）swimming pool water，（b）tap water，and（c）liquid milk samples after standard addition

表1 樣品加標回收率Table 1 Spiked recoveries of samples

3 結(jié)論

本文建立了以鈦膠正相高效液相法檢測三聚氰胺和三聚氰酸的最佳檢測條件。與三聚氰胺相比，三聚氰酸在食品安全領(lǐng)域還沒有廣泛引起人們對其危害的關(guān)注，但是作為游泳池水消毒液原料之一的三聚氰酸已經(jīng)引起了人們的注意。由于三聚氰酸常與三聚氰胺共同存在，建立一個簡便快速并且可以同時測定三聚氰酸和三聚氰胺的方法是十分必要的。本文在不進行較復(fù)雜樣品前處理的情況下，對液態(tài)奶、自來水和游泳池水進行了加標分析三聚氰胺和三聚氰酸。但是對于像奶制品這樣基體復(fù)雜的樣品來說，需要進行較為復(fù)雜的前處理才可以將三聚氰胺與基體中的干擾物質(zhì)分開，因此若想將此方法應(yīng)用于復(fù)雜樣品，還需要采取更有效的樣品前處理方法，從而避免基體物質(zhì)對三聚氰胺測定時產(chǎn)生的干擾。

[1]Melnick RL，Boorman GA，Haseman JK，et al.Urolithiasis and bladder carcinogenicity of melamine in rodents[J].Toxicol Appl Pharm，1984，72（2）：292-303.

[2]Dobson RLM，Motlagh S，Quijano M，et al.Identification and characterization of toxicity of contaminants in pet food leading to an outbreak of renal toxicity in cats and dogs[J].Toxicol Sci，2008，106（1）：251-262.

[3]Ogasawara H，Imaida K，Ishiwata H，et al.Urinary bladder carcinogenesis induced by melamine in F344 male rats：correlation between carcinogenicity and urolith formation[J].Carcinogenesis，1995，16（11）：2773-2777.

[4]Filigenzi MS，Puschner B，Aston LS，et al.Diagnostic determination of melamine and related compounds in kidney tissue by liquid chromatography/tandemmass spectrometry[J].Agric Food Chem，2008，56（17）：7593-7599.

[5]王紹安，覃衛(wèi)國，劉永峰，等.強氯精用于游泳池水消毒的實驗研究[J].中國氯堿，2002（7）：31-33.

[6]閆欣，李潔，孫杰，等.反相高效液相色譜法分析三聚氰酸[J].環(huán)境化學(xué)，2011，30（2）：567-568.

[7]吳彩梅，白潔，賈剛，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞組織中的三聚氰胺和三聚氰酸[J].食品科學(xué)，2010，31（12）：185-192.

[8]Desmarchelier A，Cuadra MG，Delatour T，et al.Simultaneous quantitative determination of melanine and cyanuric acid in cow’s milk and milk-based infant formula by liquid chromatographyelectrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Agric Food Chem，2009，57（16）：7186-7193.

[9]Tran BN，Okoniewski R，Storm R，et al.Use of methanol for the efficient extraction and analysis of melamine and cyanuric acid residues in dairy products and pet foods[J].Agric Food Chem，2010，58（1）：101-107.

[10]Tang HW，Ng KM，Chui SY，et al.Analysis of melamine cyanurate in urine using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].Anal Chem，2009，81（9）：3676-3682.

[11]Garber EA.Detection of melamine using commercial enzymelinked immunosorbent assay technology[J].J Food Prot，2008，71（3）：590-594.

[12]李鋒格，姚偉秦，蘇敏，等.氣相色譜法-質(zhì)譜法快速測定牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸[J].色譜，2009，27（2）：233-236.

[13]Tang HP，Lai SS，Lai AY，et al.Improved method for the determination of cyanuric acid in animal feed by GC-MS[J].Chromatographia，2009，70（9/10）：1405-1410.

[14]Zhou T，Lucy CA.Separation of carboxylates by hydrophilic interaction liquid chromatography on titania[J].J Chromatogr A，2010，1217（1）：82-88.

[15]Zhou T，Lucy CA.Hydrophilic interaction chromatography of nucleotides and their pathway intermediates on titania[J].J Chromatogr A，2010，1187（1/2）：87-93.

Simultaneous determination of melamine and cyanuric acid by titania-based high performance liquid chromatography

LI Man，LI Rong，TAN Jin，JIANG Zi-tao*
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）13-0311-05

2011－10－20 *通訊聯(lián)系人

李曼（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品添加劑。

國家自然科學(xué)基金項目（20875069）；天津商業(yè)大學(xué)青年基金項目（090107）。