傳統(tǒng)魚制品中優(yōu)良葡萄球菌的篩選與鑒定

張琦琳，林勝利，聶小華

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

傳統(tǒng)魚制品中優(yōu)良葡萄球菌的篩選與鑒定

張琦琳，林勝利，聶小華*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

從鹽干魚及糟腌魚中分離純化得到158株葡萄球菌，按照肉制品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得3株優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92，其具有良好的生長特性及耐鹽性。經(jīng)梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定及16S rDNA序列分析，優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92分別為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

傳統(tǒng)魚制品，葡萄球菌，篩選，鑒定

Abstract：According to the standards of meat fermentation starter，three Staphylococcus strains（S8，S61 and S92）with excellent characteristics were isolated and screened from traditional fish products.And the results of BioMerieux VITEK-2 automation microbe system and 16S rDNA sequence analysis showed that they were Staphylococcus warner，Staphylococcus sciuri and Staphylococcus xylosus respectively.

Key words：traditional fish products；Staphylococcus；screening；identification

大量研究結(jié)果表明，葡萄球菌在發(fā)酵制品的風(fēng)味形成中發(fā)揮著重要作用，近年來逐步成為國內(nèi)外傳統(tǒng)食品的研究熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，對脂肪自動(dòng)氧化引起的酸敗及由過氧化氫酶導(dǎo)致的褪色具有良好的抑制作用，同時(shí)其分泌的蛋白酶和脂肪酶可促進(jìn)發(fā)酵食品中特殊風(fēng)味的形成與積累，有效改善產(chǎn)品品質(zhì)[1-3]。Asiedu M[4]等人從非洲西部的一種自然發(fā)酵魚腸Enam Ne-Setaakye中成功分離出葡萄球菌。Fukami K[5-6]等人從日本鯖魚魚露中成功分離出木糖葡萄球菌，并將其應(yīng)用于泰國魚露發(fā)酵，顯著提高了魚露的風(fēng)味。Anihouvi VB[7]等人從發(fā)酵木薯魚中分離出芽孢桿菌、葡萄球菌、微球菌、鏈球菌、假單胞菌等，其中芽孢桿菌和葡萄球菌為優(yōu)勢菌株，分別占分離菌株總數(shù)的48.7%和27.3%，并且已證明其擁有適度的蛋白酶和脂肪酶活力。Tremonte P[8]等人將葡萄球菌、玫瑰微球菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)，研究表明葡萄球菌、玫瑰微球菌不但可促進(jìn)乳酸菌的生長，還可以增強(qiáng)菌株的蛋白水解活性。本實(shí)驗(yàn)以鹽干魚、糟腌魚等傳統(tǒng)魚制品為原料，依據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，對其制品中葡萄球菌進(jìn)行分離純化，以期得到適合生產(chǎn)發(fā)酵魚肉制品的優(yōu)良菌株，為進(jìn)一步探討葡萄球菌在魚制品的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽干魚和糟腌魚 實(shí)驗(yàn)室自制；MSA培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉膏1g，D-甘露醇10g，氯化鈉75g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.6，121℃，滅菌20min，MSA固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加18g/L的瓊脂；耐鹽性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基MSA液體培養(yǎng)基分別添加3%、6%、9%和12%的NaCl；產(chǎn)H2S培養(yǎng)基（醋酸鉛紙條法） 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.4，112℃，滅菌20～30min。另將普通濾紙剪成0.5～1cm寬的紙條，用5%～10%的醋酸鉛溶液將紙條浸透后烘干，置于培養(yǎng)皿中滅菌備用；葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基 MSA液體培養(yǎng)基，加入倒置的杜氏小管，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.625mL，121℃滅菌20min，配制時(shí)先將蛋白胨加熱溶解，調(diào)pH后加入溴甲酚紫，再加入葡萄糖；氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基 蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖1g，蒸餾水1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，L-氨基酸5g或DL-氨基酸10g，pH6.8；石蕊牛奶培養(yǎng)基10g脫脂奶粉溶解于100mL水中，再加入4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，113℃滅菌15min；蛋白酶檢測培養(yǎng)基 以MSA固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加15%脫脂奶粉；脂肪酶檢測培養(yǎng)基 以MSA固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加15%的牛油及中性紅指示劑。

超凈操作臺、YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型恒溫生化培養(yǎng)箱、GX-9070-MBE型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SP-75紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SKY-200B震蕩培養(yǎng)箱 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；Phs-3C型數(shù)字酸度計(jì) 杭州東星儀器設(shè)備廠；85-2數(shù)顯恒溫定時(shí)磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)有限公司；BS/BT4202S型Sartorious電子天平 賽多利斯公司；PCR儀 美國BIO-RAD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄球菌的分離純化 無菌條件下，取鹽干魚、糟腌魚各10g，分別置于90mL無菌生理鹽水中勻漿并進(jìn)行梯度稀釋，選取2～3個(gè)適合稀釋梯度，采用MSA培養(yǎng)基傾注平板，30℃培養(yǎng)24h。隨機(jī)挑選單一菌落，平板劃線進(jìn)行分離，得到158株單一菌株[4]。

1.2.2 優(yōu)良葡萄球菌的篩選 將分離得到的單一菌株進(jìn)行革蘭氏染色，過氧化氫酶活性檢測，溶菌酶、溶葡萄球菌素、呋喃唑酮、桿菌肽敏感性實(shí)驗(yàn)，得葡萄球菌疑似菌株。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行凝固酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)粘實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2O2實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)[9-10]、蛋白酶活性[11-12]及脂肪酶活性[12]檢測完成菌株的篩選。

1.2.3 生長曲線的測定 將篩選所得菌株接種于MSA液體培養(yǎng)基，于30℃、150r/min下培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，于680nm測定OD值，以未接菌的MSA液體培養(yǎng)基為空白對照液。

1.2.4 耐鹽性實(shí)驗(yàn) 將篩選所得菌株接種到分別添加有0%、3%、6%、9%、12%NaCl的MSA液體培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min下培養(yǎng)24h，以未接菌的MSA液體培養(yǎng)基作為空白對照液，于680nm測定OD值。

1.2.5 梅里埃VITEK-2系統(tǒng)鑒定 待測菌株經(jīng)純培養(yǎng)后，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陽性鑒定卡，VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行操作。

1.2.6 16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列分析 將篩選所得菌株接種至MSA固體培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)24h。應(yīng)用一對通用引物（正向引物16S rDNA-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物16S rDNAR：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S rDNA基因[13]。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：引物16S rDNA-F和16S rDNA-R各1.5μL，10×PCR緩沖液5μL，dNTP（2.5mmol/L）3μL，Taq酶（5U/μL）1μL，重蒸水38μL。滅菌牙簽挑取適量菌體，加入反應(yīng)體系內(nèi)。

PCR程序設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交上海INVITROGEN公司進(jìn)行測序，測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對及相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄球菌的分離及篩選

采用MSA培養(yǎng)基，從鹽干魚和糟腌魚中分離純化得158株單一菌株，其中革蘭氏陽性、球狀、H2O2酶陽性、溶葡萄球菌素和呋喃唑酮敏感、溶菌酶和桿菌肽不敏感的葡萄球菌疑似菌126株。依據(jù)肉制品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出能夠耐受6%NaCl、發(fā)酵蔗糖不產(chǎn)粘、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2O2、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氨、不具有氨基酸脫羧酶活性及凝固酶反應(yīng)陰性、溶血實(shí)驗(yàn)陰性，同時(shí)具備良好的蛋白酶及脂肪酶活力的優(yōu)良葡萄球菌株3株（S8、S61及S92），如表1。

表1 篩選葡萄球菌菌體形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of mycelia morphology and physiological biochemical test

2.2 優(yōu)良葡萄球菌的生長特性

2.2.1 生長曲線 將篩選得到的3株優(yōu)良葡萄球菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，分析其生長情況，如圖1所示。由圖可知，優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92表現(xiàn)出相似的生長趨勢，皆從4h后進(jìn)入對數(shù)生長期，18h后進(jìn)入生長平穩(wěn)期，這表明篩選得到的三株優(yōu)良葡萄球菌均具備良好的生長特性。菌液OD值在0～1.0范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，當(dāng)測定值超出線性范圍，則應(yīng)稀釋適當(dāng)比例后再進(jìn)行測定，經(jīng)換算最終確定菌液OD值。

圖1 優(yōu)良葡萄球菌的生長曲線Fig.1 The growth curve of the excellent Staphylococcus

2.2.2 耐鹽性實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵肉制品加工過程中，食鹽具有調(diào)味、防腐保鮮及提高持水能力等作用。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的食鹽可抑制腐敗菌的生長，同時(shí)對發(fā)酵菌株也會產(chǎn)生一定的影響，因此一般要求發(fā)酵菌株耐鹽性可達(dá)6%[14]。

耐鹽性實(shí)驗(yàn)（圖2）表明，NaCl含量對葡萄球菌的生長有著不同程度的影響，其中優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92在3%～6%NaCl含量的MSA培養(yǎng)液中生長較為旺盛，此后隨著NaCl濃度的增加，其生長情況均受到不同程度的抑制，但在含有12%NaCl含量的培養(yǎng)液中仍可生長，培養(yǎng)液OD值依然保留在0.6～1.0之間，這說明優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92具有較強(qiáng)的耐鹽性。

圖2 優(yōu)良葡萄球菌的耐鹽性Fig.2 The salt tolerance of the excellent Staphylococcus

2.3 優(yōu)良葡萄球菌的鑒定

2.3.1 梅里埃VITEK-2系統(tǒng)鑒定結(jié)果 根據(jù)梅里埃VITEK-2系統(tǒng)鑒定結(jié)果分析（表2），優(yōu)良葡萄球菌S8可能為沃氏葡萄球菌，其匹配度為96%；優(yōu)良葡萄球菌S61可能為松鼠葡萄球菌，其匹配度為95%；優(yōu)良葡萄球菌S92可能為木糖葡萄球菌，其匹配度為99%。

圖3 待測菌株P(guān)CR擴(kuò)增16S rDNA凝膠電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of PCR-amplification of 16S rDNA from the strains

表2 梅里埃VITEK-2鑒定結(jié)果Table 2 Identification results by VITEKⅡsystem

2.3.2 16S rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 用1%瓊脂糖凝膠對優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，經(jīng)溴乙錠染色后，三者均在1500bp左右出現(xiàn)熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（如圖3）。將PCR產(chǎn)物送交上海INVITROGEN公司進(jìn)行序列測定，測得優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92的序列長度分別為1460、1472、1452bp。PCR產(chǎn)物測得序列采用軟件DNAStar、Clustalx與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行Blast同源性比對，并應(yīng)用MEGA4.1軟件的鄰位相連（Neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖4）。結(jié)果表明，優(yōu)良葡萄球菌S8、S61和S92的遺傳進(jìn)化分別與已知沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri G7，Staphylococcus warneriR-38534，Staphylococcus warneri R-36520）、已知松鼠葡萄球菌（StaphylococcussciuriDSM 20345，StaphylococcussciuriCTSP9，Staphylococcus sciuri R10-5A）和已知木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus AF515587，Staphylococcus xylosus AY395016，Staphylococcus xylosus 741）同處于一個(gè)最小分支，同源性高達(dá)99%～100%。

結(jié)合梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定結(jié)果，進(jìn)一步確定優(yōu)良葡萄球菌S8為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），S61為松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri），S92為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

圖4 優(yōu)良葡萄球菌S8、S61、S92的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of excellent strains S8，S61，S92

3 結(jié)論

3.1 從鹽干魚和糟腌魚中篩選得到三株優(yōu)良葡萄球菌（S8、S61和S92），具有較好的蛋白酶活性和脂肪酶活性，且表現(xiàn)出良好的生長特性和耐鹽性。

3.2 根據(jù)菌株形態(tài)特征、梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定結(jié)果及16S rDNA序列測定綜合分析，葡萄球菌S8、S61和S92分別為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

[1]CasaburiA，VillaniF，ToldráF，etal.Proteaseandesteraseactivity of Satphylococci[J].Int J Food Microbiol，2006，112：223-229.

[2]Durica Zuber A，Horvat M.Influence of starter cultures on the free fatty acids during ripening in tea sausages[J].Eur Food Res Technol，2007，224：511-517.

[3]Luècke F K.Utilization of microbes to process and preserve meat[J].Meat Sci，2000，56（3）：105-115.

[4]Asiedu M，Sanni A I.Chemical composition and microbiological changes during spontaneou and starter culture fermentation of Enam Ne-Setaakye，a west african fermented fish-carbohydrate product[J].Eur Food Res Technol，2002，215：8-12.

[5]Fukami K，F(xiàn)unatsu Y，Kawasaki K，et al.Improvement of fish-sauce odor by treatment with bacteria isolated from the fish-sauce mush（Moromi） made from frigate mackerel[J].J Food Sci Tech，2004，69（2）：45-49.

[6]Fukami K，Satomi M，F(xiàn)unatsu Y，et al.Characterization and distribution of Staphylococcus sp implicated for improvement of fish sauce odor[J].Fisheries Sci，2004，70：916-923.

[7]AnihouviV B，Sakyi-Dawson E，AyernorG S，etal.Microbiological changes in naturally fermented cassava fish（Pseudotolithus sp.） for lanhouin production[J].Int J Food Microbiol，2007，116：287-291.

[8]Tremonte P，Reale A，Di Renzo T，et al.Interactions between Lactobacillus sakei and CNC（Staphylococcus xylosus and Kocuria varians）and their influence on proteolytic activity[J].Lett Appl Microbiol，2010，51：586-594.

[9]王永霞，牛天貴.肉品發(fā)酵劑葡萄球菌和微球菌的分離篩選及其與乳酸菌混合培養(yǎng)的研究[J].肉類工業(yè)，2004（4）：41-44.

[10]趙俊仁，孔保華.自然發(fā)酵風(fēng)干腸中葡萄球菌的篩選與鑒定[J].中國釀造，2010（10）：50-53.

[11]凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：122.

[12]陳學(xué)云，侯魯娜，丁玉庭，等.鹽干帶魚中葡萄球菌的分離鑒定及其特性研究[J].肉類工業(yè)，2010（5）：35-38.

[13]李焱生，魏民，張艾曉，等.一株異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的分離及其降解特性的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（5）：196-202.

[14]胡永金.淡水魚糜發(fā)酵及其凝膠形成機(jī)理研究[D].無錫：江南大學(xué)，2007.

Screening and identification of Staphy/ococcus from traditional fish products

ZHANG Qi-lin，LIN Sheng-li，NIE Xiao-hua*
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

TS254.1

A

1002-0306（2012）13-0178-04

2011－09－29 *通訊聯(lián)系人

張琦琳（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家863專題項(xiàng)目（2007AA09z442）。