指紋圖譜技術(shù)在乳制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用

樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國譜

（湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410200）

指紋圖譜技術(shù)在乳制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用

樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國譜*

（湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410200）

指紋圖譜技術(shù)是一種分析復(fù)雜組分或成品的有效、全面的分析方法。簡要地介紹了指紋圖譜技術(shù)的特點、研究方法以及指紋圖譜的構(gòu)建。重點概述了指紋圖譜技術(shù)在乳制品領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括特征鑒定、摻假識別、質(zhì)量過程控制以及微生物監(jiān)測四個方面。指紋圖譜技術(shù)將成為乳制品質(zhì)量控制新的發(fā)展方向。

乳制品，指紋圖譜，質(zhì)量控制，應(yīng)用

Abstract：The technology of fingerprint is an effective means to analyze the complex components and products.The characteristics，the research methods and the construction theory of the fingerprint technology were introduced briefly.Application of fingerprint technology in dairy production was discussed emphatically，including flavor characterization，adulteration identification，and quality control of processing and monitoring of microbiology.Fingerprint Technology will be a new development for dairy production quality control.

Key words：dairy production；fingerprint；quality control；application

牛奶是嬰幼兒早期除母乳外的唯一來源，其質(zhì)量關(guān)系到孩子的生命安全。然而近年來，一些因奶粉質(zhì)量問題而引發(fā)的事件層出不窮，如安徽阜陽的“毒奶粉”事件，“三聚氰胺奶粉事件”，圣元的“激素門”，以及最近的“皮革奶”等。因此，迫切需要生產(chǎn)企業(yè)建立有效的檢測手段和有力的質(zhì)量保障體系，提供更優(yōu)質(zhì)、安全、放心的乳制品。目前奶粉的鑒別方法主要有肉眼等感官鑒別法、化學(xué)分析法、中紅外光譜分析法、紫外線吸收光譜法、近紅外光譜分析法、超聲波檢測法等[1]。但是這些方法大多存在不足，一般只是測定乳制品中的單個組分或幾個組分，不能將多個組分同時進行測定，難以從本質(zhì)上、宏觀上、整體上綜合分析乳制品的質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)是一種快速、有效、全面的測定方法，強調(diào)的是圖譜的完整面貌即整體性，反映的質(zhì)量信息是綜合性的。特別是在復(fù)雜體系中，指紋圖譜能客觀反映事物的全貌，是單一指標成分鑒定方法不可比擬的。不同地域的原料乳或不同廠家生產(chǎn)的乳制品都具有各自獨特的風(fēng)味組成以及所含菌落的差異性，以區(qū)別于其它產(chǎn)品，即有自己獨一無二的“指紋特征”。本文借用中藥、白酒、香料等成熟的指紋圖譜技術(shù)，探索指紋圖譜技術(shù)在乳制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。與單一成分作為控制指標的質(zhì)量方法相比，指紋圖譜可以很好地適應(yīng)乳制品成分復(fù)雜的特點。指紋圖譜技術(shù)不僅可以評價乳制品的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，也可以判斷乳制品質(zhì)量的穩(wěn)定性以及制備工藝的合理性。

1 指紋圖譜技術(shù)的特點

指紋圖譜技術(shù)是指樣品經(jīng)適當?shù)念A(yù)處理后，采用一定的分析方法，得到能夠顯示該樣品特性的譜圖，這些圖譜就像人的指紋一樣具有專一性和代表性，且盡可能多地反映樣品的全貌，所以被稱之為指紋圖譜。

其特點在于：特征性和專屬性：通過指紋圖譜能有效鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地；可量化性：由主要特征峰的面積或比例，能有效控制樣品質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對穩(wěn)定；穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性：由圖譜采集環(huán)境或者分析測試手段決定；有效性：這應(yīng)與產(chǎn)品相聯(lián)系，并且在統(tǒng)計學(xué)上其數(shù)據(jù)有鑒別意義；完整性：表現(xiàn)多成分之間的相互關(guān)系；模糊性：成分間的協(xié)同交互作用復(fù)雜，故采用模糊數(shù)學(xué)的分析手段解決實際問題[2]。

2 指紋圖譜技術(shù)的研究方法

指紋圖譜技術(shù)的研究方法主要包括：色譜法：傳統(tǒng)的薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法和高效毛細管電泳法等；光譜法：紫外光譜法和紅外光譜法等；波譜法：質(zhì)譜法和核磁共振法等；其他方法：如X射線衍射法，分子生物學(xué)方法等[3]。其中色譜法是公認的應(yīng)用最廣也是最成熟的指紋圖譜技術(shù)的研究方法。

氣相色譜法（GC）主要用于分析氣體、揮發(fā)性和半揮發(fā)性液體以及能夠產(chǎn)生足夠蒸汽壓的固體，或者沸點在500℃以下，相對分子質(zhì)量400u以下的物質(zhì)。GC的特點是靈敏度高、分離度好、分析速度快[4]。

高效液相色譜法（HPLC）是一種具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速的分離分析技術(shù)。它給出的是高分辨率的輪廓圖譜，重現(xiàn)性好、操作相對容易、在線操作外界影響因素小、色譜穩(wěn)定性好，是目前指紋圖譜研究應(yīng)用最多的一項技術(shù)[5]。

DNA指紋圖譜技術(shù)屬于分子生物學(xué)方法的范疇，可用于鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)?。由于同種生物體具有相同的DNA序列，生物的不同個體或不同種群在DNA結(jié)構(gòu)上存在著差異，可依據(jù)此來鑒定生物物種。隨著微量DNA提取技術(shù)和PCR擴增、RAPD隨機擴增標記技術(shù)的發(fā)展，使DNA的提取更加便捷準確。在分子水平上檢測基因多態(tài)性，比形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測結(jié)果更加準確可靠。

3 指紋圖譜的構(gòu)建

指紋圖譜的構(gòu)建步驟為：

a.樣品采集：考慮到樣品批次不同所導(dǎo)致的差異，要在一定數(shù)量的樣品中，選擇合適數(shù)量的樣品進行檢測。一般要求至少六個批次的標準樣品進行檢測，把獲取的原始圖譜（圖像）進行平均，得出標準圖譜[6]。

b.圖譜數(shù)據(jù)的采集：樣品經(jīng)過或不經(jīng)過預(yù)處理，選取適當?shù)姆椒ń⒅讣y圖譜，進一步確定該方法所對應(yīng)的各項參數(shù)。例如，采用色譜法進行指紋圖譜分析，則要確定進樣方式和進樣量以及所使用的色譜條件，包括色譜柱的選擇、載氣、溫度、流速、質(zhì)譜條件等[7]。

c.數(shù)據(jù)分析：對獲得的圖譜進行比較分析，尋找分離好、分辨率高、重現(xiàn)性好的圖譜，進行圖譜辨認和評價，找出具有規(guī)律性的“共性”和“個性”。常用的數(shù)據(jù)分析方法有：直觀比較法、量化數(shù)據(jù)比較法、化學(xué)模式識別法、計算機軟件分析等[8]。

4 指紋圖譜技術(shù)在乳制品中的應(yīng)用

4.1 特征鑒定

不同區(qū)域的原料乳或不同品牌的乳制品，由于地理分布、氣候條件等環(huán)境因素的不同和地域文化特征的差異，其中所含揮發(fā)性物質(zhì)的含量和比例以及所含菌落的多樣性和差異性也不盡相同。它們的指紋圖譜會表現(xiàn)出相同的特征，也就是共性部分，當然也會有部分指紋圖譜的表現(xiàn)不同，這就是決定原料乳或成品獨有的個性部分，需經(jīng)鑒別系統(tǒng)進行進一步的識別。不同的地區(qū)或不同的奶源基地可以建立各地收奶地區(qū)的指紋圖譜庫，以表現(xiàn)不同的地方特色，而且不同產(chǎn)地的原料乳或成品將組成全國的乳制品指紋圖譜庫。

據(jù)報道采用固相微萃取-氣相色譜-頂空-質(zhì)譜（SPME-GC-HS-MS）法，不經(jīng)前處理，可直接對奶油進行分析，其質(zhì)量指紋圖譜既可用于鑒別進口新西蘭天然奶油，也可用于鑒別不同生產(chǎn)國所生產(chǎn)的天然奶油[9]。

C Fernandez等人分別于春夏冬三季在法國的高原地帶（奧弗涅山脈）和較低地區(qū)（布列塔尼半島）共收集有代表性的原料乳樣品35個。乳脂肪中提取的單萜烯類和倍半萜類物質(zhì)采用頂空氣質(zhì)聯(lián)用法定量，通過多因辨別分析將原料乳樣品分類。發(fā)現(xiàn)奧弗涅高地的原料乳較布列塔尼半島含有更多的倍半萜，全部樣本按照原產(chǎn)地域正確歸類，不受其季節(jié)性畜群管理模式的影響。根據(jù)地域范圍和生產(chǎn)條件，通過萜烯混合物可以得到有價值的乳制品特征指紋圖譜[10]。

I Bonizzi等人通過16S-23S ITS-PCR技術(shù)，建立了高山牧場、低地牧場所產(chǎn)原料乳中微生物群落的指紋圖譜，該指紋圖譜可表現(xiàn)生物多樣的特征。結(jié)果表明生產(chǎn)意大利干酪的阿爾卑斯山地區(qū)的原料乳包含了各種各樣的細菌群落，而細菌群落的組成與牧場的海拔有關(guān)[11]。

4.2 摻假識別

部分奶農(nóng)或奶站為牟取暴利，添加三聚氰胺、皮革蛋白等以次充好，以假亂真，利用指紋圖譜技術(shù)可以有效打擊乳制品的制假售假。首先，根據(jù)季節(jié)等外界因素的不同，選取足夠多的樣本，以其出峰的先后順序及相對含量的多少為特征，建立本地區(qū)穩(wěn)定的原料乳基礎(chǔ)指紋圖譜庫；其次，以基礎(chǔ)指紋圖譜庫為參照，將被鑒別的樣本指紋圖譜與基礎(chǔ)指紋圖譜庫進行對比，根據(jù)出峰數(shù)量、保留時間、峰形大小等參數(shù)對圖譜進行定性識別，尋找是否存在差異的未知峰；最后，參數(shù)吻合則為合格，如果存在差異峰則需進一步的深入研究，選取合適的內(nèi)標物應(yīng)用質(zhì)譜將未知峰定性。

曾慶方等人通過建立牛奶的HPLC-MS指紋圖譜，提取原料奶的特征信息，在樣品分析后的特征信息中扣除本底數(shù)據(jù)庫中已有的參考值，對異常參數(shù)值進行分析、確證，找出異?；衔?。HPLC-MS指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于牛奶中有害藥物篩查，較之用單一成分或指標監(jiān)控，其質(zhì)量更具有科學(xué)性、全面性和可追溯性，也從根本上解決了其他現(xiàn)有分析技術(shù)必須多種方法結(jié)合使用以及多項指標必須同時檢測才能對其質(zhì)量合格與否做出判斷的弊端，大大提高了質(zhì)量控制和評價的技術(shù)水平和科技含量[12]。

王顏紅等人采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了原料奶指紋圖譜，在一定程度上客觀反映了原料奶的整體質(zhì)量特征。在此基礎(chǔ)上，選取有代表性有害物如防腐劑苯甲酸等進行了標準添加，建立了危害物的標準添加圖譜，對沈陽地區(qū)超市的50個純牛奶樣品進行了篩查，取得初步應(yīng)用結(jié)果，為原料奶的質(zhì)量控制和奶制品中有害物篩查體系的研究提供了方法學(xué)參考[13]。

4.3 質(zhì)量的過程控制

在保證了上游奶源質(zhì)量安全的基礎(chǔ)上，指紋圖譜技術(shù)同樣也可以應(yīng)用在乳制品質(zhì)量過程控制和出廠檢驗。指紋圖譜的特征可以反映半成品或成品內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，又能表現(xiàn)各批次間的差異性，是判定原輔料及產(chǎn)成品質(zhì)量穩(wěn)定的重要手段。因此，乳制品生產(chǎn)企業(yè)可以建立自己的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，以此來指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化工藝、降低成本、實現(xiàn)利潤最大化。

袁潔等人認為指紋圖譜相似度是利用色譜流出曲線中保留時間對色譜峰進行匹配，然后對匹配峰進行比值計算，綜合計算出圖譜之間的相似度，從而實現(xiàn)對樣品差異程度的評價。既可評價產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性，又可評價產(chǎn)品之間的差異性，具有直觀、全面的優(yōu)點[14]。

I Proudy等人收集并歸類了200個分離的阪崎腸桿菌，其中70%表現(xiàn)出相同的指紋圖譜，表示在生產(chǎn)環(huán)境中有阪崎腸桿菌的存在。此方法可用于發(fā)現(xiàn)干混營養(yǎng)素方法生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中微生物的污染，同時，可實現(xiàn)一系列其他的控制管理，以減少最終產(chǎn)品受阪崎腸桿菌的污染[15]。

J Banykó等人采用PCR分析提取分離的芽孢桿菌，單引物定向擴增各物種的box重復(fù)序列作為特征序列，生乳和巴氏殺菌乳中所被污染的蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌種不同，而且乳制品生產(chǎn)過程中存在的一些BOX類型在原料乳中卻沒有。BOX-PCR指紋圖譜技術(shù)可以表征乳制品生產(chǎn)環(huán)境中桿菌的菌群，因此可用作證實環(huán)境是否被污染以及牛奶生產(chǎn)過程中桿菌的繁殖[16]。

4.4 微生物的檢測

通過指紋圖譜技術(shù)檢測乳制品中的乳酸菌，可實現(xiàn)乳酸菌組成及濃度的實時監(jiān)測，進而反映產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。此外，原料乳及乳制品在加工、運輸和流通等環(huán)節(jié)都有可能受到雜菌的污染，應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可鑒定有害微生物菌種的組成、預(yù)測環(huán)境微生物可能存在的污染風(fēng)險等。

李武等人利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)對市售某品牌酸奶進行了一個月的動態(tài)監(jiān)測，共收集了6個生產(chǎn)批次的18個酸奶樣品，結(jié)合常規(guī)分離培養(yǎng)方法，對樣品微生物組成及其穩(wěn)定性進行跟蹤監(jiān)測。結(jié)果顯示所有供試樣品在整個動態(tài)監(jiān)測期內(nèi)DGGE指紋圖譜都出現(xiàn)2條帶，其微生物組成比較穩(wěn)定，分別為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。通過菌種組成及其穩(wěn)定性兩個指標對酸奶樣品質(zhì)量進行評價，該技術(shù)可以作為酸奶質(zhì)量控制和動態(tài)監(jiān)測的快速、簡便的新方法[17]。

靳淼等人對引進直投型酸奶發(fā)酵劑（DVS）中乳桿菌進行分離鑒定，利用MRS半選擇性培養(yǎng)基對其進行分離，采用糖發(fā)酵實驗、全細胞蛋白電泳和RAPD指紋圖譜三種方法對其鑒定。結(jié)果表明，引進直投型酸奶發(fā)酵劑中乳桿菌由兩株菌構(gòu)成[18]。

B E Gillespie等人使用聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜技術(shù)，將美國田納西州和新西蘭的牛乳房分泌物中分離出的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌進行分類。數(shù)據(jù)表明新西蘭的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌與美國田納西州截然不同，認為DNA指紋圖譜技術(shù)可以作為一個流行病學(xué)的工具，用來區(qū)分鏈球菌，同時可以鑒定農(nóng)場中乳腺炎病原菌的來源[19]。

Robin M等人研究了脫脂乳粉、嬰兒配方奶粉、卵磷脂、可可粉等食品，每種食品的PCR指紋圖譜經(jīng)過電泳分析，該譜帶與產(chǎn)腸毒素的芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA指紋圖譜有關(guān)。利用rep-PCR得到的DNA指紋圖譜不僅是確定細菌基因類型的工具，也是食品微生物學(xué)中質(zhì)量控制和衛(wèi)生監(jiān)測的獨特方法[20]。

5 應(yīng)用前景

隨著人們生活水平的提高，乳制品已經(jīng)走進了千家萬戶，以其營養(yǎng)豐富、口味獨特、品種多樣等特點吸引著越來越多的消費者。面對如此龐大的乳制品消費市場，保證乳制品質(zhì)量安全顯得非常重要。指紋圖譜技術(shù)對于乳制品這種特殊復(fù)雜的物質(zhì)來說，可以實現(xiàn)多組分、多指標同時測定，在特征的鑒定，摻假的鑒別，質(zhì)量的過程控制等方面應(yīng)用較廣，真正實現(xiàn)從原料、配方到生產(chǎn)工藝及產(chǎn)成品全方位的穩(wěn)定、可控。指紋圖譜技術(shù)在乳制品中的應(yīng)用研究雖然起步較晚，但是從長遠來看，其將成為乳制品質(zhì)量控制新的發(fā)展方向。

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Application of fingerprint technology in dairy production quality control

FAN Ping，ZHANG Ren-ming，HE Wu-ming，XIAO Lian-rong，REN Guo-pu*
（Hunan AVA Dairy CO.，Ltd.，Changsha 410200，China）

TS252.1

A

1002-0306（2012）13-0417-04

2011－05－18 *通訊聯(lián)系人

樊萍（1982-），女，碩士研究生，助理工程師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏。

長沙市重大專項（K1003191-21）。