Snail和Claudin-3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

李娟 涂媛 蔣莉莉 徐緩 張尚福

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年有超過一百萬人死于肺癌，占癌癥總死亡人數(shù)的26%-29%[1]。其中，80%的患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。由于早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時已處于晚期，導(dǎo)致其預(yù)后差，5年生存期約為15.6%[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition, EMT）被認(rèn)為是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail是調(diào)控EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。它主要通過與上皮鈣粘素（E-cadherin）啟動子區(qū)的E-box連接基序結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時直接抑制緊密連接蛋白（Claudin）的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。近年來對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制研究發(fā)現(xiàn)Snail能提高多種腫瘤的侵襲能力。Claudin是構(gòu)成緊密連接（tight junction, TJ）的骨架蛋白，有24個異構(gòu)體，具有參與維持細(xì)胞的屏障功能，決定細(xì)胞旁物質(zhì)選擇滲透性和細(xì)胞極化等重要生理功能，其表達(dá)數(shù)量和分布結(jié)構(gòu)的變化直接影響TJ的結(jié)構(gòu)和功能[3,4]。Claudin-3是其家族成員。人類Claudin-3定位于7q11.23。人體內(nèi)乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、卵巢上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜、食管黏膜、胰腺腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管和胰島細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞、支氣管和肺泡上皮細(xì)胞中均有Claudin-3的表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)Claudin-3在某些腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和食管腺癌的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增高[5-10]，而在大腸癌中表達(dá)下調(diào)，其具體機制尚不完全清楚[11]。

本實驗利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色檢測Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，探討兩者在NSCLC中表達(dá)的意義，為其應(yīng)用于NSCLC的診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院1998年1月-2003年12月手術(shù)切除的NSCLC病例，從中選出臨床資料完整和石蠟組織保存完好的病例共302例，組織學(xué)類型包括鱗狀細(xì)胞癌（以下簡稱鱗癌）、腺癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌。其中伴有轉(zhuǎn)移灶146例，實際收集其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性癌組織57例。另取同期手術(shù)的59例癌旁正常肺組織作為對照?；颊呓刂列g(shù)前均未行放療或化療。所有標(biāo)本均由病理學(xué)教授帶領(lǐng)復(fù)習(xí)HE染色切片，明確病理診斷。302例NSCLC標(biāo)本均經(jīng)切片、HE染色，明確病理診斷（2003年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)）。其中，男性243例，女性59例，男：女為4.12:1。發(fā)病年齡35歲-82歲，中位年齡61歲。鱗癌138例，腺癌124例，腺鱗癌33例，大細(xì)胞癌7例。其中高分化癌（包括高分化鱗癌、高分化腺癌）20例；中分化癌（包括中分化鱗癌、中分化腺癌）131例；低分化癌（包括低分化鱗癌、低分化腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌）151例。TNM分期，I期98例（Ia期10例，Ib期88例），II期71例（IIa期25例，IIb期46例），III期112例（IIIa期92例，IIIb期20例），IV期21例（2009年肺癌國際分期修訂版）。生存時間0.06個月-96個月，中位生存時間35.3個月。I期患者的5年生存率為37.8%，II期為32.9%，III期為8.0%，IV期患者基本都在2年內(nèi)死亡。生存期的計算從手術(shù)日期起到隨訪日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 組織芯片的制作 采用手工制作組織芯片。首先根據(jù)HE染色切片觀察，確定代表性病變部位后在組織切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標(biāo)志，并在空白石蠟塊上鉆孔，組織片直徑與孔徑一致（內(nèi)徑為1.5 mm），再用金屬空心管從經(jīng)定位的目標(biāo)石蠟塊上鉆取組織并轉(zhuǎn)移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應(yīng)位置。連續(xù)切片后，將切下的5 μm厚組織裱于經(jīng)防脫片處理的載玻片上，置于56oC烤箱中烘烤72 h。常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學(xué)染色 兔抗人Snail多克隆抗體和兔抗人Claudin-3多克隆抗體分別購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司和福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組化試劑盒和DAΒ顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Snail一抗的工作稀釋濃度為1:50，實驗采用MaxVision法；Claudin-3為工作液，實驗采用EnVision法進行免疫組化染色，具體步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進行。分別用已知陽性的胃腺癌組織和結(jié)腸腺癌組織作為Snail和Claudin-3的陽性對照，以0.01 mol/L PΒS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 Snail和Claudin-3以細(xì)胞核或/和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片高倍鏡下隨機選取10個視野共記錄1,000個細(xì)胞，綜合染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)量進行判定。①按切片中細(xì)胞著色深淺評分：0分為細(xì)胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評分：0分為＜5%；1分為5%-＜25%；2分為25%-＜50%；3分為50%-＜75%；4分為≥75%。取①、②兩項評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1分-4分為弱陽性（+）；5分-8分為中等強度陽性（++）；≥9分為強陽性（+++）[12]。

所有染色結(jié)果的判定和計數(shù)均采用統(tǒng)一的評分標(biāo)準(zhǔn)，在對樣本臨床資料完全不知的情況下，由兩名研究者分別對實驗結(jié)果進行判斷、評分。若兩人評定結(jié)果相差3分則重新評定。

1.5 統(tǒng)計分析 等級資料采用秩和檢驗，采用Spearman等級相關(guān)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法（組間生存率比較采用Log-rank檢驗）和Cox比例風(fēng)險回歸模型進行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) Snail和Claudin-3陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)或/和細(xì)胞核。兩種蛋白陽性表達(dá)均見于支氣管上皮和II型肺泡上皮細(xì)胞。在間質(zhì)組織中也可見Snail和Claudin-3的陽性信號（圖1）。在NSCLC原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)強度不同（圖2，圖3) 。

Snail在癌旁正常肺組織、NSCLC原發(fā)灶以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)逐漸增強，陽性率分別為47.5%（28/59）、92.1%（278/302）及96.5%（55/57），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=89.097, P＜0.05)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Snail在NSCLC原發(fā)癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁正常肺組織（P＜0.05）、低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織（P＞0.05）。Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發(fā)灶以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)逐漸減弱，陽性率分別為88.1%（52/59）、60.3%（182/302）及45.6%（26/57），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.667, P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在NSCLC原發(fā)癌組織中的陽性表達(dá)率分別低于癌旁正常肺組織（P＜0.05）、高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織（P＞0.05）（表1）。

圖 1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織中的表達(dá)（A: Snail, MaxVision; B: Claudin-3, EnVision;×400）Fig 1 Expression of Snail and Claudin-3 in normal lung tissues (A: Snail, MaxVision; B:Claudin-3, EnVision; ×400)

圖 2 Snail在NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)（MaxVision, ×400）Fig 2 Expression of Snail in NSCLC primary foci and lymph node metastases (MaxVision,×400). A: Squamous cell carcinoma; B:Lymph node metastases of squamous cell carcinoma; C: Adenocarcinoma; D: Lymph node metastases of adenocarcinoma. NSCLC:non-small cell lung cancer.

2.2 Snail和Claudin-3在NSCLC原發(fā)灶中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 NSCLC原發(fā)灶中，Snail和Claudin-3的表達(dá)均與腫瘤組織學(xué)類型（χ2=9.443, P=0.024; χ2=23.863,P＜0.05）有關(guān)。而與患者的年齡、性別以及腫瘤大小、病理分級、有無癌轉(zhuǎn)移和TNM分期無關(guān)（表2）。

2.3 Snail和Claudin-3在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析顯示，Snail和Claudin-3在NSCLC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.178, P=0.002）。

2.4 Snail和Claudin-3表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.4.1 Kaplan-Meier單因素生存分析 將Snail和Claudin-3表達(dá)分為表達(dá)（+-+++）和不表達(dá)（-）兩組。Snail表達(dá)組和不表達(dá)組5年生存率分別為8.3%和0.7%；Claudin-3表達(dá)組和不表達(dá)組5年生存率分別為6.0%和3.0%。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者生存曲線，Log-rank檢驗不同樣本的生存曲線，結(jié)果顯示（圖4，圖5）：Snail不同表達(dá)之NSCLC患者的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.539,P=0.215）。Claudin-3不同表達(dá)之NSCLC患者的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.942, P=0.086）。

圖 3 Claudin-3在NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)（EnVision, ×400）Fig 3 Expression of Claudin-3 in NSCLC primary foci and lymph node metastases(EnVision, ×400).A: Squamous cell carcinoma; B: Lymph node metastases of squamous cell carcinoma;C: Adenocarcinoma; D: Lymph node metastases of adenocarcinoma.

圖 4 Snail表達(dá)組和Snail不表達(dá)組NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig 4 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with or not expression of Snail

圖 5 Claudin-3表達(dá)組和Claudin-3不表達(dá)組NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig 5 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with or not expression of Claudin-3

2.4.2 Cox比例風(fēng)險回歸模型分析 對患者的年齡、性別、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Snail和Claudin-3的表達(dá)等可能與預(yù)后有關(guān)的指標(biāo)進行分析。采用前向逐步法，顯示在α=0.05的水平上，腫瘤大小、組織學(xué)類型、病理分級、有無癌轉(zhuǎn)移、TNM分期這5個因素被篩入Cox模型內(nèi)（表3），是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素。其中，腫瘤大小、組織學(xué)類型、有無癌轉(zhuǎn)移和TNM分期的偏回歸系數(shù)為正值，表明腫瘤越大、分化程度越低和伴有癌轉(zhuǎn)移，患者死亡的風(fēng)險越大。病理分級的偏回歸系數(shù)為負(fù)值，說明分化愈低，患者死亡風(fēng)險愈高。由相對危險度得知：NSCLC的腫瘤直徑＞3 cm的患者其死亡風(fēng)險是直徑≤3 cm患者的1.68倍；伴有癌轉(zhuǎn)移的患者其死亡風(fēng)險較不伴有癌轉(zhuǎn)移患者增加了58.5%；隨著腫瘤分級由高到低的變化，患者的死亡風(fēng)險依次增加31.6%。隨著TNM分期的遞增，患者的死亡風(fēng)險依次增加52.5%。NSCLC患者的性別（P=0.639）、年齡（P=0.783）、Snail的表達(dá)（P=0.561）、Claudin-3的表達(dá)（P=0.265）和Snail與Claudin-3的差異性表達(dá)（P=0.265）對患者預(yù)后的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 Snail和Claudin-3在癌旁正常肺組織、NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)Tab 1 Expression of Snail and Claudin-3 in normal lung tissues, NSCLC primary foci and lymph node metastases

表 2 Snail和Claudin-3的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression of Snail and Claudin-3 and pathological charaeteristics of NSCLC

表 3 Cox回歸模型篩選的影響NSCLC患者的危險因素Tab 3 The risk fact of NSCLC patients selected by Cox regression model

3 討論

EMT是指細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過程，具有轉(zhuǎn)分化特征，即上皮細(xì)胞極性喪失及其間質(zhì)特性獲得。上皮細(xì)胞極性喪失表現(xiàn)為上皮標(biāo)記如E-cadherin、Claudin、Occludins和Muc1的丟失，是EMT的重要特征之一。E-cadherin是上皮細(xì)胞表面的粘附分子，對于細(xì)胞之間的粘附起到重要的作用。Claudin是構(gòu)成TJ的骨架蛋白，對維持細(xì)胞完整性起著至關(guān)重要的作用[5]。E-cadherin和Claudin表達(dá)下調(diào)常使細(xì)胞之間的粘附能力下降、凝聚力降低、分化變差、轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強。此外，Claudin-3不僅具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間物質(zhì)流動和維持上皮細(xì)胞極性的功能，還參與細(xì)胞增殖分化、基因轉(zhuǎn)錄、腫瘤抑制等過程。故在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，Claudin在不同的腫瘤組織中發(fā)揮不同的作用，表達(dá)也不相同。Claudin-3在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌中表達(dá)上調(diào)[6-9]，而在大腸癌及NSCLC中表達(dá)下調(diào)[10,11]。

本實驗結(jié)果顯示，在59例癌旁正常肺組織中，Claudin-3的陽性表達(dá)見于支氣管上皮和II型肺泡上皮細(xì)胞。在302例NSCLC原發(fā)癌組織中，Claudin-3的陽性表達(dá)率為60.3%，Claudin-3在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁正常肺組織，其表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、有無轉(zhuǎn)移以及TNM分期無關(guān)。Claudin-3在不同組織學(xué)類型NSCLC中的表達(dá)各不相同，具體陽性表達(dá)率如下：在鱗癌中為50%；在腺癌中為69.3%；在腺鱗癌中為87.9%；在大細(xì)胞癌中為28.6%。其表達(dá)率由高到低分別為腺鱗癌、腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。其他學(xué)者的研究也證實Claudin-3在不同組織學(xué)類型肺癌中的表達(dá)存在差異，這種差異有助于肺癌組織學(xué)類型的區(qū)分[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)Claudin-3的表達(dá)與前列腺癌的臨床病理分期及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，在III期、IV期腫瘤組織中的表達(dá)高于I期、II期，在復(fù)發(fā)腫瘤中的表達(dá)高于無復(fù)發(fā)腫瘤。本實驗中，Claudin-3在NSCLC原發(fā)癌組織中I期、II期患者中表達(dá)率低于在III期、IV期患者中的表達(dá)率，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

EMT的另外一個重要方面是間質(zhì)特性的獲得，即間質(zhì)標(biāo)記如成纖維細(xì)胞樣的外形、波形纖維蛋白、Snail、骨橋蛋白基因的表達(dá)。Snail是鋅指轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，其主要功能是調(diào)控EMT。E-cadherin被認(rèn)為是Snail直接作用的靶基因。Snail主要以鋅指區(qū)域與E-cadherin啟動子上的E-box序列結(jié)合，達(dá)到抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄的作用。腫瘤發(fā)生EMT時，E-cadherin的表達(dá)降低或缺失、細(xì)胞間的粘附力減弱、細(xì)胞之間彼此分離、獲得活動能力并抵抗凋亡，腫瘤細(xì)胞易于從原發(fā)灶上脫落。而腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的第一步，也是EMT發(fā)生的標(biāo)志。Snail通過抑制E-cadherin、Claudin-3等的表達(dá)來促進EMT的發(fā)生，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，Snail在乳腺癌、食管鱗癌、肺癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[14-19]，并與腫瘤的組織學(xué)類型、病理分級、侵襲轉(zhuǎn)移、生存時間等有關(guān)。

本研究顯示，59例癌旁肺組織中，Snail在支氣管上皮和II型肺泡上皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)；在302例NSCLC中，Snail陽性表達(dá)率為92.1%。Snail在NSCLC中的表達(dá)高于正常肺組織，與文獻報道一致[18]。Snail在302例NSCLC原發(fā)癌組織中的表達(dá)與患者的組織學(xué)類型有關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、有無轉(zhuǎn)移以及TNM分期無關(guān)。Snail不同組織學(xué)類型NSCLC中表達(dá)不同，具體陽性表達(dá)率如下：在鱗癌中為87%；在腺癌中為96.8%；在腺鱗癌中為94%；在大細(xì)胞癌中為100%。其表達(dá)率由高到低分別為大細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌和鱗癌。本實驗結(jié)果提示，在NSCLC中，Snail可能具有促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和腫瘤演進的作用，尚有待進一步深入研究證實。

本研究顯示，Snail和Claudin-3在NSCLC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩種蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起不同的作用。

目前，有學(xué)者在研究肺癌靶向治療時將目光瞄準(zhǔn)了Snail和Claudin-3。如通過siRNA靶向干擾Snail的表達(dá)可增加順鉑誘導(dǎo)的A546肺癌細(xì)胞的凋亡，聯(lián)合化療藥物和靶向抑制Snail因子大大提高了肺癌治療的有效性[20]；或者通過siRNA沉默Snail基因的表達(dá)或通過反義Snail阻止EMT和腫瘤的轉(zhuǎn)移，利用化療藥物抑制Snail蛋白的生成，可望能有效地抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而大大提高抗腫瘤效力。而圍繞Claudin-3靶向治療的研究主要在于兩個方面：抗Claudin抗體的制備和利用肉毒素產(chǎn)氣莢膜桿菌（clostridiumperfringens enterotoxin, CPE）定位Claudin。前者基于利用抗Claudin抗體對抗Claudin的細(xì)胞外域。后者利用CPE與Claudin-3的結(jié)合，CPE是分子量為35 kDa的單鏈多肽，其功能區(qū)由N-末端的細(xì)胞毒域和C-末端的受體結(jié)合域組成。Claudin-3作為CPE的受體與其結(jié)合，CPE結(jié)合在Claudin-3的第二個細(xì)胞外環(huán)。將從銅綠假單胞菌外毒素（pseudomonas aeruginosa exotoxin）中提取的蛋白合成抑制因子PSIF與CPE的C-末端（C-CPE）融合形成Claudin-3靶向分子C-CPE-PSIF。此分子能識別細(xì)胞極性，且腫瘤內(nèi)注射C-CPE-PSIF能抑制腫瘤生長。所以，C-CPE可能成為藥物輸送和腫瘤治療的一個新分子[21]。研究證實，C-CPE與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）融合后可抑制卵巢癌細(xì)胞生長，CPE片段可能成為Claudin靶向治療的工具[22]。實驗中利用Claudin-3 siRNA可抑制卵巢癌小鼠腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。因此，siRNA 介導(dǎo)的Claudin基因沉默也是潛在的抗腫瘤藥物[23]。Claudin靶向治療可能使NSCLC的治療取得突破性的進展[24]。

綜上所述，Snail和Claudin-3的表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以作為判斷NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)指標(biāo)，對腫瘤預(yù)后的判斷有一定的參考價值。同時，在腫瘤的靶向治療中具有潛在應(yīng)用價值。