巴豆中佛波醇酯類成分及其生物活性研究進(jìn)展

王 磊， 劉 振， 高文遠(yuǎn)， 張靜澤

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072;2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300380)

巴豆Croton tigliumL.為大戟科Euphorbiaceae巴豆屬植物，又名巴菽、剛子、江子、老陽子、雙眼龍、猛子仁等。巴豆種子供藥用，種子的油即巴豆油，有大毒，作峻瀉劑;其根、葉也可入藥，治療風(fēng)濕骨痛等;民間亦用其枝、葉作殺蟲藥或毒魚［1］。

對(duì)于巴豆的化學(xué)成分研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者更多的側(cè)重于巴豆種子的研究，巴豆油是巴豆種子中的主要成分和藥效活性成分，亦為毒性成分，刺激皮膚，其主要的化學(xué)成分是佛波醇二萜酯類化合物［2-4］，是一個(gè)具有四環(huán)巴豆烷母核的二萜酯類化合物。

1 佛波醇酯分離方法

佛波醇酯類化合物不穩(wěn)定，對(duì)熱、光、氧氣、酸和堿較敏感，在分離過程中容易發(fā)生氧化、酯化和差向異構(gòu)化［5］，因此，需要在無氧環(huán)境下分離，萃取時(shí)采用氮?dú)饣蛘邭鍤獗Ｗo(hù)，常用的分離方法是將巴豆用甲醇提取后，除去溶劑后，殘余物溶于甲醇-水 (一般比例為9∶1)混合溶液中，用己烷分配除去長(zhǎng)鏈脂肪酸，然后用乙醚萃取，得到富含二萜類化合物的乙醚提取物。經(jīng)硅膠和硅酸鎂吸附柱層析分為幾個(gè)部位，再采用液滴逆流色譜和薄層制備的方法進(jìn)一步分離［6］，或者采用液滴逆流色譜和低壓柱層析方法聯(lián)用［7］;由于液滴逆流色譜的復(fù)雜性以及不廣泛性，隨后，Ocken［8］采用干柱色譜的方法從巴豆油中分離出佛波醇酯類化合物;隨著制備液相的出現(xiàn)，Mekkawy［9］等采用中壓色譜柱的方法分離得到佛波醇酯類化合物。

2 佛波醇酯結(jié)構(gòu)

1941年，Berenblum［10］從巴豆油中發(fā)現(xiàn)佛波醇酯化合物，1967年Hecker［11］確定該類化合物結(jié)構(gòu)，由于巴豆油中的該類成分極性較小，其分離獲得比較困難，早期，Marshall［7］液滴逆流色譜方法對(duì)其進(jìn)行分離，巴豆油經(jīng)環(huán)己烷提取后，用甲醇-水 (20∶3)萃取后采用DCCC(環(huán)己烷-二乙醚-異丙醇-乙醇-水作為上相流動(dòng)相)進(jìn)行洗脫，然后再采用不同流動(dòng)相的DCCC方法進(jìn)行分離，以及采用制備薄層色譜的方法獲得不同的佛波醇酯化合物;日本學(xué)者M(jìn)ekkawy［9］采用中壓色譜柱的方法對(duì)其進(jìn)行分離，巴豆采用甲醇提取后，采用極性小的環(huán)己烷或者乙醚萃取后，經(jīng)環(huán)己烷-乙酸乙酯硅膠柱洗脫后，得到粗的成分，再采用RP-18硅膠柱 (甲醇-乙腈，1∶1)分離后，用中壓色譜柱(RP-18，RP-2，Si60)采用不同的洗脫系統(tǒng) (甲醇-水;環(huán)己烷-乙醚-乙酸乙酯)進(jìn)行分離?，F(xiàn)已從巴豆中分離出33種佛波醇酯化合物［12］(化合物1～33，見圖1，表1)，并采用LC-MS-MS，通過三步法確定該化合物的特征碎片離子，根據(jù)分子量快速簡(jiǎn)便鑒定化合物［13］。

圖1 佛波醇酯化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)母核

3 佛波醇酯衍生物

El-Mekkawy［9，14］通過比較巴豆油中的 8 個(gè)佛波醇酯化合物抗HIV-1活性，合成了成了44個(gè)佛波醇酯衍生物 (化合物34～74，化合物86～88);化合物12抑制HIV-1的活性很強(qiáng)，但是該化合物在血漿中不穩(wěn)定，為了得到活性強(qiáng)且在血漿中穩(wěn)定的化合物，以該化合物為基礎(chǔ)合成了C-13位不變，C-12位為醚鍵的5個(gè)衍生物［15］(化合物75～79)。同時(shí)根據(jù)化合物24具有抗HIV-1活性而無腫瘤促進(jìn)作用［16］，合成了6個(gè)巴豆醇-13-單酯化合物［17］(化合物80～85)。上述55種衍生物是改變?nèi)〈孽ユ滈L(zhǎng)度，并未引入極性大的官能團(tuán)，極性的變化并不大，Bertolini［18］等又合成了21種C-12，C-13為極性官能團(tuán) (如酰胺、羧酸、銨鹽)的佛波酯類似物。

表1 佛波醇酯化合物結(jié)構(gòu)

圖2 佛波醇酯衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)母核

對(duì)佛波醇酯的結(jié)構(gòu)改造，多數(shù)是在保持母核不變而只改變側(cè)鏈的取代基發(fā)現(xiàn)活性強(qiáng)的化合物，Wender［19］等則通過改變母核結(jié)構(gòu)合成了4種 (化合物89～92)佛波醇酯衍生物。而Yamatsugu［20］根據(jù)佛波醇酯化合物結(jié)合蛋白激酶C(PKC)的能力，合成了9種佛波醇酯類衍生物(化合物93～101)，從中尋找特異性抑制PKCα受體的化合物。佛波醇酯特殊的五元環(huán)結(jié)構(gòu)除了能夠激動(dòng)或抑制蛋白激酶C外，還能和其它受體結(jié)合，從而產(chǎn)生不同的生物活性，如4α-佛波醇酯化合物對(duì)蛋白激酶C無活性，但是它可以激活瞬時(shí)感受器香草素電位離子通道 (TRPV4)，據(jù)此合成了多種佛波醇酯衍生物［21］。

表2 佛波醇酯衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)

續(xù)表2

4 佛波醇酯化合物的生物活性

佛波醇酯類化合物具有多效生物活性，研究最多的是其與蛋白激酶C結(jié)合產(chǎn)生的作用，毒性方面如促腫瘤形成、炎癥、細(xì)胞增殖、血小板聚集等作用，但同時(shí)也有抗HIV-1引起的細(xì)胞病變、抗紅白血細(xì)胞等作用。

4.1 調(diào)節(jié)蛋白激酶C 佛波醇酯化合物與二酰甘油(DAG)相似，為蛋白激酶C激動(dòng)劑，均調(diào)節(jié)依賴Ca2+(α，βⅠ，βⅡ，γ)和非依賴Ca2+(δ，ε，η，θ，μ)的蛋白激酶C同工酶［22-23］，并且作用機(jī)制相似，都結(jié)合到蛋白激酶C的C1領(lǐng)域，但佛波醇酯與蛋白激酶C是不可逆結(jié)合［24］，如化合物2能夠激活蛋白激酶C產(chǎn)生毒副反應(yīng)，如誘發(fā)腫瘤、刺激皮膚等，而有些如化合物12卻能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，說明佛波醇酯的結(jié)構(gòu)影響其作用。采用合成的方法探討其關(guān)系，通過改變母核結(jié)構(gòu)合成不同的佛波醇酯衍生物，化合物91和92與蛋白激酶C的親和力強(qiáng)，說明C-2的剛性結(jié)構(gòu)起著重要的作用［19］;C-3，4，9，20位的羥基自由基與蛋白激酶C的親和力密切相關(guān);C-12，13位取代基的疏水性/親水性影響蛋白激酶C的活性［25］，其中C-12位酯鏈?zhǔn)菦Q定化合物是否為蛋白激酶C激動(dòng)劑/抑制劑的基本因素［26］，由此合成了一系列的化合物，當(dāng)C-12，C-13為極性官能團(tuán) (如酰胺、羧酸、銨鹽)時(shí)，能夠使得蛋白激酶C的遷移能力降低，即促癌活性降低，這兩位為短的羧酸鏈就可以使蛋白激酶C的活性降低90%，最有可能成為蛋白激酶C抑制劑的化合物為C-12，13位為羧酸的佛波酯類似物［18］。但是在合成過程中又發(fā)現(xiàn)了一種新的作用機(jī)制，當(dāng)C-12位存在缺電子的芳香基團(tuán)時(shí)，能顯著提高化合物與蛋白激酶C的親和力［20］，說明這兩者的親和力不僅與母核上的羥基自由基有關(guān)，還與C-12位的取代基的電子云有關(guān)。蛋白激酶C有多種亞型結(jié)構(gòu)，得到其某一亞型的專一性激動(dòng)劑或抑制劑是發(fā)現(xiàn)新藥的關(guān)鍵點(diǎn)，從中尋找特異性抑制PKCα受體的化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)化合物97、98的活性強(qiáng)，判斷出缺電子的芳香環(huán)和聚醚側(cè)鏈均為抑制蛋白激酶 C 的重要基團(tuán)［20］。

圖5 佛波醇酯骨架結(jié)構(gòu)與蛋白激酶C活性的關(guān)系

4.2 抗HIV-1作用 從巴豆油中分離出的化合物2、12、25和33能夠完全抑制HIV-1誘導(dǎo)的MT-4細(xì)胞病變作用(IC100分別為 7.6 ng/mL、7.81 μg/mL 和 0.48 ng/mL)［9］;從Homalanthus nutans中分離出的Prostratin(化合物24)具有強(qiáng)的抗 HIV-1活性［16］;以及從Euphorbia poissonii和Euphorbia resiniferaBerg中分離出的脫氧佛波醇酯類化合物也具有強(qiáng)的抗HIV-1作用［27］，雖然都是佛波醇酯類化合物并且均可以抑制HIV-1引起的細(xì)胞病變，但是產(chǎn)生的細(xì)胞作用不同，通過合成不同的佛波醇酯衍生物發(fā)現(xiàn)化合物的構(gòu)型明顯地影響其活性［14-15，17］，如 C-4位為 α-OH或被甲氧基取代則失活;C-20位被乙酸取代后，活性明顯下降;C-3位羰基改為羥基后，活性降低;增加或減少脂肪酸碳鏈的數(shù)目都能明顯降低活性。如今利用合成的方法得到的抗HIV-1活性強(qiáng)、毒性小的為化合物75和化合物84，并且化合物84的活性強(qiáng)于化合物24 10倍［15，17］。

4.3 毒副作用 巴豆油有一定的毒副作用，主要包括刺激性、致癌性、抑制蛋白質(zhì)合成和遺傳損傷作用。對(duì)于巴豆引起的致癌作用報(bào)道的也較多，如小鼠口服巴豆油可引起胃部乳頭狀瘤及癌;大鼠腹腔注射巴豆油，可降低肝癌抑制因子水平;與其他致癌物合用時(shí)，致癌率也明顯提高。

4.3.1 炎癥作用 巴豆油具有強(qiáng)的皮膚刺激作用，外用對(duì)皮膚、黏膜有強(qiáng)烈的刺激性，引起發(fā)紅，口服半滴至1滴即能產(chǎn)生口腔及胃黏膜的燒灼感及嘔吐，并產(chǎn)生嚴(yán)重腹瀉，甚至消化道出血、腎臟損傷、血尿、血閉等。灌胃給予小鼠兩周后，電子顯微鏡下可見空腸、結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞腫脹，及炎癥反應(yīng);巴豆油酸可引起腹痛、腹瀉等消化道炎癥，甚至引起腸壞疽;巴豆毒素作為一種劇烈的原形毒物，可引起皮膚、黏膜發(fā)赤、氣泡等炎癥?；衔?是最強(qiáng)的刺激劑 (作用機(jī)制見圖6)［28］。佛波醇酯的結(jié)構(gòu)影響其活性，化合物33不能引起炎癥，而能引起細(xì)胞增生［29］;12-脫氧巴豆醇酯類化合物有炎癥作用［30］。研究發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈取代基不同時(shí)，刺激能力、炎癥達(dá)峰時(shí)間和持續(xù)時(shí)間亦不同，一般單酯比二酯的刺激能力強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而炎癥的持續(xù)時(shí)間與母體結(jié)構(gòu)中自由羥基的個(gè)數(shù)相關(guān)，但是4位的構(gòu)型 (α與β)與炎癥持續(xù)時(shí)間無關(guān)［31］，并且抗組胺藥或前列腺素合成酶抑制劑對(duì)巴豆油引起的皮膚炎癥不起作用，而皮質(zhì)醇或相關(guān)的皮質(zhì)甾醇類藥物能夠抑制該作用［32］。

圖6 佛波醇酯引起的炎癥反應(yīng)

4.3.2 促腫瘤形成 1941年，Berenblum［10］從巴豆油中發(fā)現(xiàn)佛波醇酯類化合物，將其涂抹到小鼠皮膚時(shí)發(fā)現(xiàn)它能加速腫瘤的形成;1947年，Berenblum和Shubik［33］發(fā)現(xiàn)它的促癌活性僅是在用了致癌劑后才具有，本身不具有致癌作用，1979 年，Matsukura［34］等人將巴豆油和N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍用于小鼠實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)這兩者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，沒有產(chǎn)生胃癌，但是同時(shí)應(yīng)用時(shí)，在小鼠中出現(xiàn)了胃癌細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了巴豆油的促癌而非致癌作用。Hecker［6］從巴豆油中分離出了12，13-佛波醇酯類化合物，并確定其為潛在的促癌活性成分，其中化合物2是最強(qiáng)的促癌劑。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究后，該類化合物能夠促進(jìn)腫瘤形成，是由于其能夠激活蛋白激酶C［35］，從而調(diào)節(jié)信號(hào)通道引起基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增生。巴豆毒素通過抑制蛋白質(zhì)合成、溶解紅細(xì)胞，使局部組織發(fā)生變性、壞死，可導(dǎo)致死亡［12］。

而有些佛波醇酯化合物卻能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞的凋零死亡。在一些惡性腫瘤細(xì)胞中，佛波醇酯化合物激活蛋白激酶C后，會(huì)發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞會(huì)停止生長(zhǎng)或者凋零死亡，有多種因素影響這一活性的改變，如蛋白激酶C激活的多種代謝途徑、蛋白激酶C的磷酸化作用、蛋白激酶C的細(xì)胞定位、蛋白激酶C與其它信號(hào)分子的相互作用以及蛋白激酶C與不同底物的結(jié)合［36-37］，但是化合物12能夠抑制細(xì)胞的病變且不激活蛋白激酶C［14］，說明化合物的結(jié)構(gòu)亦影響其活性。

4.4 其它作用 佛波醇酯還能引起血小板的聚集、細(xì)胞增殖以及抗白血病等作用，如化合物2能夠引起人紅白血細(xì)胞中巨核細(xì)胞的病變，前列環(huán)素能夠抑制該作用，前列腺素對(duì)其無影響，推斷該作用可能通過環(huán)單磷酸腺苷［38］;化合物8可以對(duì)抗P388淋巴細(xì)胞癌及抗白血病的活性［34］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，佛波醇酯化合物對(duì)不同組織和動(dòng)物種類有不同的作用，呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)，如既能激動(dòng)蛋白激酶C亦能抑制蛋白激酶C，同樣對(duì)平滑肌作用時(shí)也會(huì)出現(xiàn)收縮和松弛雙向作用，如化合物14和化合物17對(duì)人支氣管的作用是先松弛后收縮，最初的松弛作用是激活了Na+/K+-ATPase，而隨后的收縮作用則依賴于細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入［39］。研究富含該類化合物的巴豆油時(shí)，也發(fā)現(xiàn)這種雙向調(diào)節(jié)作用［40］，如采用兔離體空腸平滑肌模型，研究巴豆油對(duì)其的收縮作用，表明該作用與濃度有關(guān)，濃度低時(shí)收縮;濃度高時(shí)則無收縮作用，作用機(jī)制是通過M3毒蕈堿受體和 L-型 Ca2+通道［41］介導(dǎo)。

5 結(jié)語

雖然巴豆有毒副作用，但是已有兩千年的藥用歷史特別適用于胃腸道疾病，如腸梗阻、腹瀉、腸炎、菌痢等，能夠治療頑固性便秘，臨床應(yīng)用廣泛，巴豆油富含的佛波醇酯化合物，既是毒性分成也為活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，該類化合物具有多種生物活性，但是對(duì)巴豆本身的瀉下作用機(jī)制研究較少，研究最多的是其與蛋白激酶的關(guān)系。雖然從巴豆發(fā)現(xiàn)的該化合物數(shù)目有限，但是以其特殊的四元環(huán)母核合成一系列衍生物是發(fā)現(xiàn)活性好、毒性小化合物的主要方法，也表明研究該化合物具有較好的應(yīng)用開發(fā)潛力。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京，1996，44(2):133-134.

［2］Bertenrath J G M.150 years of croton oil research［J］.Experientia，1969，25(1):1-5.

［3］王 媛，鄒忠梅.巴豆屬植物中二萜類成分研究概況［J］.國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2006，28(1):17-27.

［4］Salatino A，Salatino M L F.Negri G.Traditional uses，chemistry and pharmacology ofCrotonspecies(Euphorbiaceae)［J］.J Braz Chem Soc，2007，18(1):11-33.

［5］Haas W，Sterk H，Mittelbach M.Novel 12-deoxy-16-hydroxyphorbol diesters isolated from the seed oil ofJatropha curcas［J］.J Nat Prod，2002，65(10):1434-1440.

［6］Hecker E.Phorbol esters from croton oil.Chemical nature and biological activities［J］.Naturwissenschaften，1967，54(11):282-284.

［7］Marshall G T，Kinghorn A D.Short-chain phorbol ester constituents of croton oil［J］.J Am Oil Chem Soc，1984，61(7):1220-1225.

［8］Ocken P R.Dry-column chromatographic isolation of fatty acid esters of phorbol from croton oil［J］.J Lipid Res，1969，10(4):460-462.

［9］El-Mekkawy S，Meselhy M R，Nakamura N，et al.Anti-HIV-1 phorbol esters from the seeds ofCroton tiglium［J］.Phytochemistry，2000，53(4):457-464.

［10］Berenblum T.The co-carcinogenic action of croton resin ［J］.Cancer Res，1941，1:44-48.

［11］Hecker E，Bartsch H，Bresch H，et al.Structure and stereochemistry of the tetracyclic diterpene phorbol fromCroton tigliumL.［J］.Tetrahedron Lett，1967，33(8):3165-3170.

［12］胡 靜.巴豆霜推進(jìn)腸運(yùn)動(dòng)物質(zhì)基礎(chǔ)和胃腸安丸抗內(nèi)毒素作用研究［D］.天津:天津大學(xué)，2009.

［13］Vogg G，Achatz S，Kettrup A，et al.Fast，sensitive and selective liquid chromatographic-tandem mass spectrometric determination of tumor-promoting diterpene esters［J］.J Chromatogr A，1999，855(2):563-573.

［14］El-Mekkawy S，Meselhy M R，Abdel-Hafez A A，et al.Inhibition of cytopathic effect of human immunodeficiency virus type-1 by various phorbol derivatives［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2002，50(4):523-529.

［15］Matsuya Y，Yu Z，Yamamoto N，et al.Synthesis of new phorbol derivatives having ethereal side chain and evaluation of their anti-HIV activity ［J］.Bioorg Med Chem，2005，13(14):4383-4388.

［16］Gustafson K R，Cardellina J H，Mcmahon J B，et al.A nonpromoting phorbol from the samoan medicinal plantHomalanthus nutansinhibits cell killing by HIV-1［J］.J Med Chem，1992，35(11):1978-1986.

［17］Marquez N，Calzado M A，Sanchez-Duffhues G，et al.Differential effects of phorbol-13-monoesters on human immunodeficiency virus reactivation ［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(6):1370-1380.

［18］Bertolini T M，Giorgione J，Harvey D F，et al.Protein kinase C translocation by modified phorbol esters with functionalized lipophilic regions［J］.J Org Chem，2003，68(13):5028-5036.

［19］Wender P A，Kirschberg T A，Williams P D，et al.A new class of simplified phorbol ester analogues:synthesis and binding to PKC and ηPKC-C1B(ηPKC-CRD2)［J］.Org Lett，1999，1(7):1009-1012.

［20］Yamatsugu K，Motoki R，Kanai M，et al.Identification of potent，selective Protein Kinase C inhibitors based on a phorbol skeleton［J］.Chem Asian J，2006，1(3):314-321.

［21］Klausen T K，Pagani A，Minassi A，et al.Modulation of the transient receptor potential vanilloid channel TRPV4 by 4α-phorbol esters:A structure activity study［J］.J Med Chem，2009，52(9):2933-2939.

［22］Nishizuka Y.Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses［J］.FASEB J，1995，9(7):484-496.

［23］Ron D，Kazanietz M G.New insights into the regulation of protein kinase C and novel phorbol ester receptors［J］.FASEB J，1999，13(13):1658-1676.

［24］Mosior M，Newton A C.Mechanism of interaction of protein kinase C with phorbol esters.Reversibility and nature of membrane association［J］.J Biol Chem，1995，270(43):25526-25533.

［25］Zhang G Y，Kazanietz M G，Blumberg P M，et al.Crystal structure of the Cys2 activator-binding domain of protein kinase Cδ in complex with phorbol ester［J］.Cell，1995，81(6):917-924.

［26］Wada R，Suto Y，Kanai M，et al.Dramatic switching of protein kinase C agonist/antagonist activity by modifying the 12-ester side chain of phorbol esters［J］.J Am Chem Soc，2002，124(36):10658-10659.

［27］Bocklandt S，Blumberg P M，Hamer D H.Activation of latent HIV-1 expression by the potent anti-tumor promoter 12-deoxyphorbol 13-phenylacetate ［J］.Antivir Res，2003，59(2):89-98.

［28］Goel G，Makkar H P，F(xiàn)rancis G，et al.Phorbol esters:structure，biological activity，and toxicity in animals［J］.Int J Toxicol，2007，26(4):279-288.

［29］Fürstenberger G，De-Bravo M，Bertsch S，et al.The effect of indomethacin on cell proliferation induced by chemical and mechanical means in mouse epidermisin vivo［J］.Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1979，24(3):533-541.

［30］Hergenhahn M，Kusumoto S，Hecker E.Diterpene esters from“Euphorbium”and their irritant and cocarcinogenic activity［J］.Experientia，1974，30(12):1438-1440.

［31］Schmidt R J，Evans F J.Skin irritant effects of esters of phorbol and related polyols［J］.Arch Toxicol，1980，44(4):279-289.

［32］Belman S，Troll W.The inhibition of croton oil-promoted mouse skin tumorigenesis by steroid hormones［J］.Cancer Res，1972，32(3):450-454.

［33］Berenblum T，Shubik P.The role of croton oil applications associated with a single painting of a carcinogen in tumor induction of the mouse’s skin［J］.Br J Cancer，1947，1(4):379-382.

［34］Matsukura N，Kawachi T，Sano T，et al.Promoting action of croton oil on gastrocarcinogenesis byN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in rats［J］.J Cancer Res Clin Oncol，1979，93(3):323-327.

［35］Wender P A，Koehler K F，Sharkey N A，et al.Analysis of the phorbol ester pharmacophore on protein kinase C as a guide to the rational design of new classes of analogs［J］.Proc Natl Acad Sci，1986，83(12):4214-4218.

［36］Brodie C，Blumberg P M.Regulation of cell apoptosis by protein kinase Cδ［J］.Apoptosis，2003，8(1):19-27.

［37］Gonzalez-Guerrico A M，Kazanitez M G.Phorbol ester-induced apoptosis in prostate cancer cells via autocrine activation of the extrinsic apoptotic cascade a key role for protein kinase C［J］.J Biol Chem，2005，280(47):38982-38991.

［38］Shen H W，Chen Y L，Chern C Y，et al.The effect of prostacyclin agonists on the differentiation of phorbol ester treated human erythroleukemia cells ［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2007，83(3):231-236.

［39］Sarriá B，Pedrós C，Galan G，et al.Effects of phorbol 12，13-diacetate on human isolated bronchus ［J］.Eur J Pharmacol，2000，399(1):65-73.

［40］Murthy K S，Yee Y S，Grider J R，et al.Phorbol-stimulated Ca2+mobilization and contraction in dispersed intestinal smooth muscle cells［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，294(3):991-996.

［41］Hu J，Gao W Y，Gao Y，et al.M3muscarinic receptor-and Ca2+influx-mediated muscle contractions induced by croton oil in isolated rabbit jejunum［J］.Ethnopharmacol，2010，129(3):377-380.