間歇性低氧動物模型的建立及驗證

李秀翠 蔡曉紅 溫正旺 梁冬施 曹順順 胡青青 潘國權(quán) 陳尚勤

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)指上呼吸道反復(fù)塌陷堵塞引起的呼吸暫停和通氣不足，主要表現(xiàn)為打鼾，伴呼吸暫停、夜間反復(fù)低氧血癥、高碳酸血癥、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂以及白天嗜睡，兒童OSAHS發(fā)病率達1%～3%，老年人的發(fā)病率更高。研究表明OSAHS與冠心病、高血壓病、動脈粥樣硬化關(guān)系密切，越來越受到人們的重視［1～4］。間歇性低氧是其特征性的病理機制，IH模型普遍用于研究OSAHS的低氧機制，但IH模型是否有效地模擬OSAHS前人尚未充分驗證，因此本實驗建立并驗證IH模型，以確保模型的有效性。

材料與方法

1.材料:SPF級雄性SD幼鼠20只，體重100±10g，溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心［SYXK(浙)2005－0061］提供;動物實驗復(fù)合模擬艙及對照艙由本實驗室聯(lián)合濰坊華信氧業(yè)有限公司研制;其他主要儀器和材料:血氣分析儀(GEM Premier 3000)、醫(yī)用氧氣和高純度氮氣(濃度＞99.99%，本市醫(yī)用氧氣廠)、水銀體溫計、秒表。

2.氧艙的制備:氧艙的建立參照 Nair等［5］和 Wang 等［6］等的方法加以改進。氧艙的主體設(shè)備主要由以下部分組成:①動物實驗復(fù)合模擬艙:60cm×22cm×16cm;②動物實驗對照艙;③氮氣管道;④氧氣管道;⑤空氣管道;⑥空氣壓縮機;⑦氣體流量控制閥;⑧PLC及電腦控制系統(tǒng)。氧艙側(cè)壁上各有4個進氣、排氣單向閥，不同氣源有不同的通氣管道，均由程序控制電磁閥開關(guān)，艙內(nèi)壓力始終保持常壓。通過自行設(shè)定實驗參數(shù)及各種氣體的流量值并輸入電腦控制程序，調(diào)控艙內(nèi)氧氣濃度，模擬不同的IH環(huán)境，氣體流入狀態(tài)可通過控制程序經(jīng)顯示器讀出，艙內(nèi)氧濃度由艙內(nèi)氧氣檢測儀讀出。氧艙置于SPF級動物實驗室內(nèi)，所有儀器設(shè)備嚴格消毒后置入。氧艙示意圖及艙體實物圖見圖1、圖2。

3.模型建立:將20只SD幼鼠隨機分為4組:90s 10%模型組(A)，60s 10%(B)模型組和60s 5%模型組(C)，空氣對照組(D)，每組各5只。設(shè)置IH氧艙參數(shù):低氧時間、常氧時間、每次循環(huán)時間、最低氧濃度上限、最低氧濃度下限、最高氧濃度上限、最高氧濃度下限，模型組參數(shù) A組:45s、45s、90s、13.05%、10.80%、20.50%、19.00%;B 組:30s、30s、60s、13.15%、10.90%、20.55%、19.25%;C 組:30s、30s、60s、7.90% 、5.55% 、20.65% 、19.25% 。實驗期間按照預(yù)設(shè)的參數(shù)向動物實驗復(fù)合模擬艙內(nèi)輸送氮氣和氧氣，通過監(jiān)測氧艙內(nèi)的氧濃度及低氧時間來控制氮氣和氧氣的進氣，保證最低氧濃度和最高氧濃度分別在如下范圍內(nèi)變化:A組和B組:10.0% ±1.5%、21.0% ±0.5%，C組:5.0% ±0.5%、21.0% ±0.5%?？諝鈱φ战M置于動物實驗對照艙內(nèi)，向?qū)φ张搩?nèi)輸送空氣，保證艙內(nèi)溫度和室內(nèi)溫度22～24℃，濕度40%～50%。氧艙內(nèi)氧濃度隨時間的變化可通過電腦界面顯示，見圖3。

圖3 氧艙電腦界面

4.動物處理:給予大鼠3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺上，分離頸總動脈，將注入肝素的留置針尾端連肝素帽，留置針插入頸總動脈，中間連接處用線扎好，縫合固定。待大鼠清醒時，測量呼吸、體溫，然后依次將其置于上述建立的氧艙模型中，2h末測量大鼠體溫、呼吸，模型組于電腦界面上正弦波達到最高點時開始抽血，D組任意時間點抽血，一個低氧－復(fù)氧周期抽血5次，同一實驗組間隔相同的時間(A、D 組均間隔22.5s，B、C組間隔15s)，每次抽血時間＜3s，抽取0.5ml動脈血，迅速行血氣分析，記錄血氣結(jié)果，5 個時間點的 PO2、SaO2分別表示為 P1、P2、P3、P4、P5，S1、S2、S3、S4、S5。動脈插管前、插管后及抽取動脈血的操作分別如圖4a、b、c。

圖4 動脈插管及動脈取血操作

5.統(tǒng)計學(xué)方法:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差±s)表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，各時間點之間的組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠體溫和呼吸次數(shù)的比較:與D組比較，A、B、C模型組造模后呼吸明顯加快，A、B、C組內(nèi)比較，造模后呼吸較造模前明顯加快(P＜0.05)，D組造模后呼吸與造模前比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);各組間及組內(nèi)體溫無差異(P＞0.05)(表1)。

表1 4組大鼠體溫和呼吸次數(shù)比較

2.4組大鼠 PO2及 SaO2比較:A、B、C 模型組組內(nèi)5個時間點的PO2及SaO2比較:F分別為67.92、300.89，449.38、108.69，2037、931.18，P 均 ＜ 0.05，有明顯差異;與其余4個時間點的PO2、SaO2比較，P3及 S3下降(P ＜0.05)，1和5，2和4時間點的 PO2及SaO2比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。D組組內(nèi)5個時間點的 PO2及 SaO2比較，F(xiàn) 分別為 1.61、2.15，P均＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。4組 PO2及 SaO2變化見圖5。

3.4組P3及S3組間比較:與D組比較，模型組P3及S3降低(P＜0.05);與 A組比較，B組 P3及 S3升高(P ＜0.05)，C 組 P3及 S3降低(P ＜0.05);C 組 P3及S3較B組降低(P＜0.05)(表2)。

討 論

圖5 4組組內(nèi)5個時間點的PO2及SaO2比較

表2 4組P3及S3組間比較

OSAHS特征性的低氧方式是慢性間歇性低氧，此低氧－復(fù)氧方式出現(xiàn)類似于缺血/再灌注過程中的病理變化，自從1992年Fletcher首次報道了慢性間歇低氧－復(fù)氧大鼠模型以來，陸續(xù)有報道間歇低氧－復(fù)氧睡眠呼吸暫停綜合征的動物模型［7～9］，建立模型的實驗裝置有不同類型:①往復(fù)運動式低氧艙，是低氧艙在動物艙之間往復(fù)運動，使動物艙間歇進入低氧環(huán)境，可基本模擬反復(fù)缺氧－復(fù)氧的病理生理特征，但對設(shè)備要求高，操作復(fù)雜;②低壓低氧艙，通過改變氧艙升降速率模擬不同的海拔高度，產(chǎn)生不同的壓力和氧濃度，從而達到低氧－復(fù)氧的效果，對設(shè)備的要求較高，不能準確反映常壓下缺氧的情況;③低O2高CO2箱，采用單片機技術(shù)和反饋原理，自動調(diào)節(jié)氧艙內(nèi)O2、CO2濃度，建立低氧和CO2潴留模型，不能排除CO2在低氧－復(fù)氧機制研究中的干擾作用。本研究制備常壓間歇性低氧氧艙來模擬睡眠呼吸暫停綜合征，符合低氧、間歇性等特點，氣源采用常用的醫(yī)用氧和醫(yī)用氮，而非混合氣體，來源簡便易得;艙內(nèi)氧濃度、氣體輸送、低氧－復(fù)氧循環(huán)時間等均采用自動控制、自動監(jiān)測，保證了實驗條件的精確性和可靠性;采用氮氣與氧氣交替輸送的方式，克服了前期一些實驗?zāi)Ｐ椭械獨?或低氧混合氣)與空氣交替輸送方式帶來的大容積艙氧濃度不易快速升高的不足;本實驗氧艙模型可由實驗者設(shè)定多項參數(shù)，研制不同低氧濃度和時間的IH模型、低氧高二氧化碳等多種氧艙模型，具備良好的人性化(圖3)。

本實驗IH氧艙模型的建立操作簡便、控制精確、具備人性化，但IH模型是否能有效地模擬OSAHS尚需充分驗證，許多學(xué)者將以下多種驗證方法結(jié)合起來，如活動減少，睡眠增多，呼吸頻率加快伴有鼾聲等，本實驗也表明缺氧時大鼠呼吸明顯加快，但該標準帶有主觀性，只能作為大致的參考;多導(dǎo)睡眠監(jiān)測對判斷該模型與人類OSAHS的相符程度具有重要的參考價值，但可靠性不佳;模型動物的上呼吸道改變對于評價OSAHS模型也十分重要，但可操作性差，而動脈血氣分析是評定IH模型動物與OSAHS病人低氧的重要依據(jù)，因此本實驗通過血氣分析評價IH氧艙模型中大鼠產(chǎn)生的低氧影響，驗證模型的有效性及合理性［10］。

IH模型的低氧－復(fù)氧循環(huán)時間多為12～90s，最低氧濃度多為 5% ～10%［11～14］。本實驗選取 90s 10%、60s 10%、60s 5%3個模型，血氣分析結(jié)果顯示:一個低氧－復(fù)氧周期內(nèi)，模型組的PO2及SaO2有明顯的波動，表明大鼠體內(nèi)處于低氧－復(fù)氧狀態(tài)，與IH氧艙內(nèi)氧濃度的變化一致，驗證了模型的有效性;OSAHS可對心血管、內(nèi)分泌、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)器官產(chǎn)生影響。本課題組前期已利用間歇性低氧大鼠模型成功模擬OSAHS對肺循環(huán)和右室功能的影響，神經(jīng)系統(tǒng)海馬、額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，空間學(xué)習(xí)記憶損害等OSAHS對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，進一步驗證了此模型的有效性。本研究組間比較結(jié)果提示不同的IH模型產(chǎn)生不同程度的低氧改變，同時表明低氧的程度與IH循環(huán)周期、低氧時間和最低氧濃度有關(guān)，從而本實驗可以通過調(diào)整上述因素建立不同的IH模型，這與羅玲等的觀點是一致的。本實驗IH模型中最低氧飽和度分別為(75±3)%、(89±1)%、(52±4)%，通過血氣分析結(jié)果中最低氧飽和度評價低氧的程度，根據(jù)阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(草案)判斷模型的分度，得出90s 10%模型可以反映輕度OSAHS，90s 10%模型模擬中重度OSAHS，60s 5%模型可以較好地反映重度OSAHS的病理變化，證明本IH模型可以有效地模擬OSAHS。

綜上所述，本實驗IH氧艙模型的建立操作簡便、控制精確、重復(fù)性佳，可模擬不同病情輕重的OSAHS，模型符合疾病的病理生理特點，是目前研究OSAHS低氧機制的理想實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

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