酸駝乳中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的胃腸道耐受特性研究

朱曉瑩，買日艷姆古麗，古麗蘇木·托呼遜，努爾古麗·熱合曼

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆珍稀瀕危物種保護(hù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830054）

益生菌也譯為“益生素、原生菌”等，意思為“有利于生命”，來(lái)源于拉丁文，是一類與宿主互利共生、有利于宿主健康的腸道生理細(xì)菌，組成明確的微生物制劑或產(chǎn)品，能通過(guò)定殖作用改變宿主某一部位菌群組成。Fuller將此定義修改為“能通過(guò)改善腸道微生物平衡而對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響的微生物活體制品”[1]。乳酸菌是利用糖類進(jìn)行發(fā)酵代謝，生成以乳酸為主的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的總稱。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)人體有降膽固醇、降血壓和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種保健作用[2]。

由于胃液的酸度非常大，通常的pH在3.0以下，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)極其嚴(yán)峻的環(huán)境，大部分乳酸菌在通過(guò)消化時(shí)到達(dá)腸道之前，因不能耐受胃液酸度而死亡，而少數(shù)菌能耐酸，只有少數(shù)耐酸的乳酸菌才能以活菌形式通過(guò)胃部。通過(guò)乳酸發(fā)酵，不僅食品的保存期得到了很大程度的延長(zhǎng)，而且賜予其中乳酸菌一定的耐受性，尤其是在家庭式傳統(tǒng)發(fā)酵食品是耐受性較強(qiáng)的乳酸菌源泉。此類耐酸性乳酸菌能在人體中更有效地發(fā)揮保健作用，因此具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，開(kāi)發(fā)出在強(qiáng)酸環(huán)境中也能較好存活的耐酸性乳酸菌，和擴(kuò)大乳酸菌的應(yīng)用范圍是息息相關(guān)的[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)體外耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)，從傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌中篩選出耐受性較強(qiáng)的優(yōu)良益生特性較強(qiáng)的乳酸菌菌株。確定其能在被攝取過(guò)程中保持較高的存活以達(dá)到攝取后能較好發(fā)揮其保健效果。研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)出適合于駝乳發(fā)酵的益生發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)，以便用于益生菌食品的開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測(cè)試菌種來(lái)源

菌種：從傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳樣品中分離鑒定的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基；人工胃液：NaCl 0.2 g，胃蛋白酶（ICN Biomedicals）0.35 g溶于適量蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，定溶至100 mL，孔徑0.22 μm微孔濾膜（Millex－GV）過(guò)濾除菌[4－5]；0.3%牛膽鹽 MRS 培養(yǎng)基；pH7.4 的 PBS buffer。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌耐酸能力測(cè)定

待測(cè)菌株（30%甘油管保存）用MRS液體培養(yǎng)基37℃、2%的接種量進(jìn)行乳酸菌的液體培養(yǎng)，無(wú)菌條件下取5 mL菌液離心，棄上清液；加入4 mL無(wú)菌生理鹽水洗滌后再離心，棄上清液；用4 mL，0.01 M，pH 7.4的PBS buffer再?zèng)_洗，離心，棄上清。沉淀中加入5 mL的人工胃液和1.5 mL PBS buffer，最終pH2.7振蕩均勻后放入37℃隨溫水浴鍋。充分混勻后放入37℃，隨溫水浴鍋；人工胃液加入0 h和恒溫2 h后2個(gè)時(shí)點(diǎn)，分別取樣稀釋涂平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以測(cè)定2 h后菌的生存率，做3個(gè)平行求平均值[5]。

1.2.2 乳酸菌耐膽鹽能力的測(cè)定

將已活化12 h～14 h的待測(cè)菌液2%的接種量分別接種至MRS液體培養(yǎng)基和含膽鹽0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)，分別在0 h、4 h和8 h取樣計(jì)數(shù)，比較兩種培養(yǎng)基中乳酸菌的生長(zhǎng)狀況，并計(jì)算其存活率，做3個(gè)平行求平均值[6]。

存活率＝膽鹽MRS培養(yǎng)基cfu/mL普通/MRS培養(yǎng)基cfu/mL×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸駝乳乳酸菌在人工胃液中生長(zhǎng)及其耐受性

本實(shí)驗(yàn)從酸駝乳中分離乳酸菌中篩選出耐人工胃液比較強(qiáng)的耐酸性菌株有15個(gè)，其中5株為極耐酸菌株見(jiàn)圖1。

從圖1中可得，這些菌株經(jīng)人工胃液處理2 h后活菌數(shù)還在108cfu/mL以上，其中M1－1②、Le2－1⑩、M1－2②、M3－1②以及 M3－1⑾等菌株對(duì) pH 2.0 的人工胃液內(nèi)也有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，因此這5株菌為極耐酸乳酸菌；，M3－3①、5－雙－球、Le2－1② 、Le2－1⑾、M4－1－5、Le3－3、M1－1③、M3－1、M4－3－2 雙球②、Le3－1①等菌株，經(jīng)人工胃液處理后的活菌數(shù)雖然有下降的趨勢(shì)，但是還在107cfu/mL以上；此結(jié)果說(shuō)明這些菌具有極強(qiáng)耐酸能力，并具有能夠通過(guò)胃，到腸道發(fā)揮益生作用的條件。結(jié)果活菌數(shù)107cfu/mL以上的，并誤差較小的15株菌作為耐酸菌；其它的菌株活菌數(shù)仍還在107cfu/mL以下，被認(rèn)為不耐酸。

2.2 耐膽鹽能力的測(cè)定

將能在pH2的環(huán)境下存活的乳酸菌M1－1等15株試驗(yàn)菌按所述的方法做0.3%牛膽酸鈉耐受性試驗(yàn)，見(jiàn)圖2。

圖2結(jié)果顯示:試驗(yàn)菌中存活率最高的是M3－3①、5－雙－球、Le3－3、M4－2 雙球、M3－3⑾、M1－4①等五株菌，其4 h后的活菌數(shù)量在107cfu/mL以上，則8 h后的活菌數(shù)量均在108cfu/mL以上；其次為M1－1②、Le2－1、M4－1－5、M1－1②M3－1⑾等四株菌，其 4 h 及 8 h后的增長(zhǎng)數(shù)量在107以上；再次為M3－1②，其4 h及8h后的活菌數(shù)量均在107cfu/mL以下；菌株Le3－1①為不能耐受0.3%的牛膽酸鈉，其4 h后沒(méi)有增長(zhǎng)趨勢(shì)。而在8 h后卻有負(fù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象。

測(cè)試菌耐受酸、耐受膽鹽具體結(jié)果見(jiàn)表1。

3 結(jié)論與討論

為使乳酸菌能在被攝取過(guò)程中保持較高的存活率以達(dá)到攝取后能較好發(fā)揮其保健效果的目的，通過(guò)耐酸試驗(yàn)從不同的酸駝乳樣品中分離并篩選出耐pH2.0的人工胃液的15株菌株。根據(jù)16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果可得，Lactobacillus brevis strain有2株，Enterococcus faecium strain有 2株，Leuconostoc lactis strain有 3株，Enterococcus sp.有 2株，Lactobacillus sakei strain有 2株，Enterococcus durans strain有 1株，15株菌有5株為極耐酸，Enterococcus durans strain，8株為中度耐酸，還有2株為低度耐酸說(shuō)明植物性乳酸菌有較強(qiáng)的耐酸性。

表1 既能耐受酸又能耐受膽鹽的菌株Table 1 The acid and bile tolerance strains

乳酸菌的抗菌、抗癌等益生特性一方面在于它對(duì)一些外來(lái)的致病菌以及病變細(xì)胞具有生物屏障作用，即乳酸菌與腸黏膜上皮細(xì)胞相互作用、密切結(jié)合構(gòu)成了生物學(xué)屏障；在此同時(shí)，通過(guò)其自身及其代謝物與其它細(xì)菌之間的相互作用，調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢(shì)組合以及這種組合的穩(wěn)定性，從而阻止了致病菌的入侵和定殖，拮抗致病菌和有害微生物的生長(zhǎng)及其毒素的黏附。以上益生作用的前提是益生菌（probiotic）必須能夠耐受胃和腸道的消化過(guò)程，所以用作益生菌的菌株必須能耐受酸和膽鹽的作用，能黏附十腸黏膜上皮細(xì)胞并能定植[7]。

乳酸菌的耐酸及耐膽汁鹽能力，能順利通過(guò)胃腸道而定植于大腸內(nèi)，與其益生作用息息相關(guān)。當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才能夠起到健康促進(jìn)效果。Kurmann等報(bào)道，乳酸菌發(fā)揮功能特性的活菌數(shù)臨界值為106cfu/mL或106cfu/g，一般流體食物在胃內(nèi)停留的時(shí)間1 h～2 h。諸多報(bào)道顯示，不同益生乳酸菌菌株對(duì)低pH的耐受能力存在一定差異。Smith研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)飲水給野兔分別喂109cfu/mL的多種菌，大腸桿菌、糞鏈球菌、魏氏梭菌、嗜酸乳桿菌，飼喂24 h后宰殺，胃內(nèi)容物pH為1.2，能檢測(cè)到嗜酸乳桿菌，未測(cè)到其它3種菌，說(shuō)明乳酸菌比其它菌更能耐受較低的pH環(huán)境而在動(dòng)物體內(nèi)生存。Conway等的研究結(jié)果表明嗜酸乳桿菌在pH為3.0，0 h菌數(shù)量為108cfu/mL，2 h為105cfu/mL[8]。

益生乳酸菌要順利進(jìn)入動(dòng)物腸道，除具有可耐受胃中低pH的能力外，還需具備耐受小腸中膽汁等形成的高滲透壓環(huán)境的能力。已有報(bào)道表明，一些乳酸菌具有一定的膽鹽耐受能力。顧瑞霞等發(fā)現(xiàn)，Bifidobacterium infantis，Lactobacillzts acidophilatsCH2，L.bulgaricus CH2，S.thermophilzts CH2四種乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受能力較好[9]。趙瑞香等研究表明，在0.3%膽鹽濃度下培養(yǎng)4 h后L.acidophilits Ind-I存活率為0.32%[3]。本研究中耐酸試驗(yàn)選用pH 2條件，耐膽鹽試驗(yàn)中膽鹽選用0.3%牛膽酸鈉。試驗(yàn)結(jié)果表明，從35株實(shí)驗(yàn)菌株中，篩選出來(lái)的15株菌株中在pH為2.0的條件下，4 h后除了菌株Le3-1之外，其它14株菌的耐酸存活率在36.51%以上，活菌數(shù)均為107cfu/mL以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了臨界值。15株耐酸乳酸菌中除了Le3-1①外，其它14株菌株均有一定的耐膽鹽能力。此結(jié)果因此證明了這些菌株能夠順利通過(guò)胃酸環(huán)境而達(dá)到腸道內(nèi)，具備功能性食補(bǔ)因子的基本要求。

本研究結(jié)果得到的乳酸菌無(wú)需在不同酸度既不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基中馴化，就有較強(qiáng)的耐酸既膽鹽耐受性，這一結(jié)果這些菌株的特殊生境有密切的關(guān)系，即當(dāng)?shù)啬撩袷人岫缺容^高的發(fā)酵奶，而且此類發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑也是已發(fā)酵的奶，他們不做酸駝奶時(shí)，低溫保存已發(fā)酵的酸駝奶；這種制作工藝恰恰給其里面的乳酸菌賜予自然馴化的生態(tài)環(huán)境，因此這些乳酸菌具有一定的耐受性。這些菌株在進(jìn)一步確定其它益生作用能力后，可應(yīng)用于益生發(fā)酵劑組分及人體不同的微生態(tài)制劑。

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