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    免疫分子佐劑ctxB在pVAX1中的初步應(yīng)用

    2012-08-21 06:41:06梅麗琴曲云鵬麻健豐江明華
    關(guān)鍵詞:溫州質(zhì)粒產(chǎn)物

    梅麗琴,曲云鵬,麻健豐,江明華

    (1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科,浙江 溫州 325027;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼陽(yáng)中心醫(yī)院 口腔科,遼寧 遼陽(yáng) 111000;3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科,浙江 溫州 325027;4.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科,浙江 溫州 325027)

    霍亂毒素(cholera toxin,CT)是由霍亂弧菌分泌產(chǎn)生,引起霍亂腹瀉的主要作用物質(zhì),由A、B兩個(gè)亞單位組成,A亞單位是整個(gè)毒素的活性中心;B亞單位(CTXB)沒有毒性,但它含有大部分毒素抗原的決定簇,有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng),能與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂GMI結(jié)合,在霍亂的抗毒免疫中起重要作用[1-2]。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)CTXB是一種較為理想的免疫分子佐劑[3]?;蚍例x疫苗是近年的一個(gè)研究熱點(diǎn),但現(xiàn)有的各種核酸防齲疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效能偏低,尚不能達(dá)到實(shí)用防齲的目的[4-5]。本實(shí)驗(yàn)將霍亂毒素B亞單位編碼基因(ctxB)克隆到真核表達(dá)載體pVAX1,構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB,并進(jìn)一步研究其在真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況,為CTXB在防齲核酸疫苗中應(yīng)用前景做基礎(chǔ)性研究。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種、質(zhì)粒及細(xì)胞株:大腸桿菌JM109購(gòu)自華美生物工程公司;CHO細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所;重組質(zhì)粒p2355(含ctxB)及真核表達(dá)載體pVAX1獲贈(zèng)于遵義醫(yī)學(xué)院劉建國(guó)教授。

    1.1.2 主要試劑和儀器:限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I、DNA分子量Marker和T4DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物公司;lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司;膠回收試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;GoldViewTM核酸染料購(gòu)自賽百盛公司;Plasmid Mini Kit I購(gòu)自O(shè)mega公司;引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。GM1為Sigma公司產(chǎn)品。羊抗CTBIgG抗體和CTB標(biāo)準(zhǔn)品為L(zhǎng)ist biological laboratories,Inc.產(chǎn)品。辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。BSA為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀為上海三科儀器有限公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 重組質(zhì)粒p2355中ctxB插入序列的測(cè)定:對(duì)含有ctxB的重組質(zhì)粒p2355進(jìn)行測(cè)序,按Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。以重組質(zhì)粒p2355為DNA模板,分別以T7序列和載體近3’端序列:5’-atgatta aattaaaatttgg-3’為引物,通過一個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)通。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)合成:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的基因序列在National Bioscience Inc研制的分子生物學(xué)軟件oligo 6.0上設(shè)計(jì)合成并評(píng)價(jià)PCR引物。上游引物:5’-GCGGGTACCACCATGGATGACCGAAGCGACATCAAGC-3’;下游引物:5’-GGGAATTCTTAACTCTCAGCTGTCAAATAA TG-3’。在上游引物的5’端加入kozak啟動(dòng)序列和EcoR I酶切位點(diǎn),在上游引物的5’端加入Not I酶切位點(diǎn)。

    1.2.3 擴(kuò)增目的基因片段ctxB:以重組質(zhì)粒p2355為模板,按下列反應(yīng)體系依次加樣:ddH2O 36.9μL 10×Exbuffer 5μL,dNTP mixture(各2.5 mmol/L)4μL,上游引物(10 pmol/μL)1μL,下游引物(10 pmol/μL)1μL,LA Taq酶0.1μL,p2355 1μL,總體積50μL。采用的循環(huán)條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 3 m 30 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min,4 ℃貯存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠,1×TAE,60 V×1 h檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,于-20 ℃保存。

    1.2.4 重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB的構(gòu)建及酶切鑒定:PCR產(chǎn)物純化按照試劑盒操作說明書進(jìn)行,用EcoR I和Not I對(duì)純化的PCR產(chǎn)物及少量提取的載體質(zhì)粒pVAX1進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后回收,按照目的基因ctxB與載體pVAX1 4:1的摩爾比在T4DNA連接酶的作用下16 ℃過夜連接。取上述連接產(chǎn)物1μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109,轉(zhuǎn)化后的JM109涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB抗性篩選平板上。37 ℃培養(yǎng)16 h后,挑取單個(gè)菌落振蕩培養(yǎng)過夜并提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切進(jìn)行鑒定后,以可以切出目的基因條帶的為陽(yáng)性克隆,送至大連Takara生物技術(shù)公司測(cè)序,鑒定構(gòu)建重組質(zhì)粒序列。

    1.2.5 脂質(zhì)體介導(dǎo)pVAX1-ctxB瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞:取1.0×105/mL的CHO細(xì)胞,接種至6孔培養(yǎng)板,每孔2 mL。24 h后,細(xì)胞匯合度達(dá)50%~80%時(shí),進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染:①分別取96μL無血清培養(yǎng)基至4個(gè)1.5 mL Eppendorf管中;②取Lipofectamine 2000 4μL分別加至上面的96μL培養(yǎng)基中,勿碰管壁;③室溫放置5 min;④加上述溶液到3個(gè)含1~2μg重組質(zhì)粒及1個(gè)作為對(duì)照的含1~2μg空質(zhì)粒的1.5 mL管中;輕輕混合,室溫溫育15~30 min;⑤沿孔周圍將上述溶液加至6孔板中的4個(gè)孔中,其余2孔作為CHO空細(xì)胞對(duì)照;⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別于24、48、72 h吸去培養(yǎng)基,冷PBS洗細(xì)胞2次。

    1.2.6 GM1-ELISA法檢測(cè)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)物:①用10μg/mL的GM1包被96孔微孔板,每孔100 μg,4 ℃過夜。②BSA封閉移去包被液,用含5% BSA的PBS2Tween20溶液37 ℃封閉2 h。③加入CHO細(xì)胞上清液:移去封閉液,加入3種不同濃度細(xì)胞上清液稀釋液(1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μg/mL),同時(shí)設(shè)對(duì)照孔。每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行孔,每孔100μL,37 ℃作用2 h。④洗滌:移去液體,用PBS2Tween20溶液洗滌3次,每次3 min。⑤加入一抗:每孔加入1:4000稀釋的羊抗CTB IgG抗體100μL,室溫作用45 min。⑥洗滌:操作同④。⑦加入酶標(biāo)二抗加入1:8000稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體,每孔100μL,室溫作用45 min。⑧洗滌:操作同④。⑨加入底物溶液:將底物OPD溶液加入96孔板,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔。每孔100 μL,室溫避光作用15 min。⑩加入終止劑測(cè)定OD值:每孔加入50μL的2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),立即測(cè)定492 nm的OD值。

    2 結(jié)果

    2.1 擴(kuò)增目的基因片段ctxB 以重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB為DNA模板,擴(kuò)增出約390 bp的目的基因片段;經(jīng)基因測(cè)序鑒定:該目的基因片段起始密碼ATG到最后1個(gè)密碼子,共有390 bp,與文獻(xiàn)中報(bào)道的ctxB基因?qū)?yīng)區(qū)域的DNA序列和氨基酸序列完全一致(見圖1)。

    圖1 ctxB PCR產(chǎn)物電泳圖

    2.2 GM1-ELISA法檢測(cè)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)物 采用SPSS 13.0分析軟件對(duì)GM1-ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,經(jīng)x2檢驗(yàn),P<0.05,證實(shí)重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB蛋白表達(dá)產(chǎn)物可以與特異性抗體相結(jié)合,具有CTXB免疫源性。

    3 討論

    近年來CTXB作為佐劑已應(yīng)用于某些細(xì)菌、病毒與寄生蟲等疫苗的研制中[6]。2000年何志勇等[7]將ctxB克隆到原核表達(dá)載體,并成功誘導(dǎo)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)蛋白。選擇適宜的佐劑不僅能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答,更能作用于特定免疫細(xì)胞,從而選擇性地誘導(dǎo)形成針對(duì)特異性抗原的有效免疫應(yīng)答[8-9]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTXB具有促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈作用,并通過B細(xì)胞LgA型的轉(zhuǎn)換使機(jī)體LgA增加,誘導(dǎo)Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-4、IL-5)等功能,并促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化,分泌Th2型細(xì)胞因子,有效地誘導(dǎo)局部黏膜免疫以及全身免疫,從而輔助目的基因片段增加免疫效果[10]。

    本研究發(fā)現(xiàn),將CTXB克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1中,通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)??梢栽谡婧思?xì)胞中高效表達(dá)具有CTXB蛋白,可以用來加強(qiáng)防齲基因疫苗的免疫效價(jià),為下一步構(gòu)建多價(jià)防齲基因疫苗打下了基礎(chǔ)。

    [1] Wang C, Luo J, Amer S, et al. Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J]. Vaccine,2011,29(2):323-328.

    [2] Pinkhasov J, Alvarez M , Pathangey LB,et al. Analysis of a cholera toxin B subunit (CTB) and human mucin 1 (MUC1)conjugate protein in a MUC1-tolerant mouse model[J]. Cancer Immunol Immun,2010,59(12):1801-1811.

    [3] Liu C, Fan M , Bian Z, et al. Effects of targeted fusion anticaries DNA vaccine pGJA-P/VAX in rats with caries[J].Vaccine,2008,26(51):6685-6689.

    [4] 孫梅芹,趙連三,王松,等.preS2S/adw真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)的初步研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2003,11(1):3-5.

    [5] 曲云鵬,劉建國(guó),楊德琴.真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1的應(yīng)用[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(2):194-196.

    [6] 楊亞波,孟曉麗,殷國(guó)榮,等. STAg和霍亂毒素滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的鼻相關(guān)淋巴組織細(xì)胞免疫應(yīng)答[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(11):1146-1149.

    [7] 何志勇,李明峰,張惟杰,等. 霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)的克隆及其表達(dá)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào), 2000,32(2):149-152.

    [8] Wang C,Luo J, Amer S, et al.Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J].Vaccine, 2011,29(2):323-328.

    [9] Matsumoto Y,Suzuki S,Nozoye T, et al. Oral immunogenicity and protective efficacy in mice of transgenic rice plants producing a vaccine candidate antigen (As16) of Ascaris suum fused with cholera toxin B subunit[J]. Transgenic Res,2009,18(2):185-192.

    [10] Flores J,DuPont HL,Paredes-Paredes M, et al. Pilot study of whole-blood gamma interferon response to the vibrio cholerae toxin B subunit and resistance to enterotoxigenic escherichia coli-associated diarrhea[J]. Clin Vaccine immunol,2010,17(5):879-881.

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