姜黃素誘導(dǎo)雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細(xì)胞凋亡

趙 雷

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，吉林 長(zhǎng)春 130117）

姜黃素誘導(dǎo)雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細(xì)胞凋亡

趙 雷

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，吉林 長(zhǎng)春 130117）

前列腺癌細(xì)胞的多耐藥性（multidrug-resistance，MDR）常常導(dǎo)致臨床上前列腺腫瘤化療的失敗。研究耐藥機(jī)制，尋找分子靶點(diǎn)，研發(fā)高效、低毒的MDR抑制劑是目前面臨的挑戰(zhàn)。研究表明，化療藥物誘導(dǎo)凋亡耐受在前列腺腫瘤細(xì)胞MDR形成過(guò)程中起著十分重要的作用。因此，尋找前列腺癌多耐藥抑制劑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以在很大程度上降低前列腺癌MDR。

姜黃素（Curcumin，Cur）是一種從姜黃根莖中提取得到的黃色色素［1］。姜黃素有重要和廣泛的藥理作用，如降血脂、抗氧化、抗發(fā)炎［2］、抗動(dòng)脈粥樣硬化等［3］。2004年時(shí)發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制HIV-1整合酶活性而用于艾滋病的臨床試驗(yàn)。此外，抗癌是姜黃素的主要藥理活性之一，其抑制腫瘤的作用已在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到反復(fù)證實(shí)，其具體抗癌機(jī)制已成為近期研究熱點(diǎn)［4，5］。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一種分布和作用均十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)多條信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的多耐藥性相關(guān)［6］。王漪等2007年研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞中NF-κB調(diào)控 MDR1基因，參與耐藥逆轉(zhuǎn)［7］。研究表明，NF-κB、Bcl-2、p53和c-jun等分子與前列腺腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［8，9］。

本研究的目的在于研究姜黃素與NF-κB信號(hào)通路的聯(lián)系，及其誘導(dǎo)雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株雄性激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，用DMEM培養(yǎng)基（含15%牛血清）在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代用0.25%胰蛋白酶液。多耐藥細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)［10］。

1.2 試劑姜黃素購(gòu)自Sigma公司；總蛋白提取、總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega。鼠源單克隆抗體：NF-κB抗體、磷酸化c－jun抗體、P-gp（P-glycoprotein）抗體、p53抗體、bcl-2抗體、GAPDH抗體購(gòu)自ABCam。HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自abcam。甲唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Promega；2×SYBR real-time PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒，ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce。

1.3 姜黃素培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞以1×106／ml的濃度接種到6孔板，孔內(nèi)放2ml DMEM（10%小牛血清），培養(yǎng)24h。換新鮮培養(yǎng)液，其中含有溶解的不同濃度姜黃素。繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別用real-time PCR和 western blot檢測(cè) NF－κB、Bcl-2、p53、磷酸化c－jun，用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖。抑制腫瘤的生長(zhǎng)率＝（無(wú)藥對(duì)照孔OD值－用藥孔OD值）／無(wú)藥對(duì)照孔OD值×100%。未添加姜黃素的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 QPCR收集細(xì)胞，用試劑盒提取總RNA，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA為模板按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行real-time PCR，每個(gè)反應(yīng)體系中均加入GAPDH的一對(duì)引物作為PCR擴(kuò)增的內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃30s-56℃60s-72℃60s，35個(gè)循環(huán)。用 Beacon designer 7根據(jù)Genbank序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)Blast驗(yàn)證，上海生工引物合成和基因測(cè)序。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測(cè)收集PC-3M／CDDP細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明，用真核細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。用12%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，凝膠通過(guò)濕轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜后，將膜置于封閉液（含10% 脫脂奶粉的PBST）中，于搖床搖勻1h。用TBST清洗三次，每次5min，棄清洗液。稀釋一抗（1∶1000）于封閉液中。將膜置于一抗液中，室溫?fù)u床1h。用TBST清洗三次，每次5 min，棄去清洗液。稀釋 HRP標(biāo)記二抗（1：500）于封閉液。將膜置于上述液中室溫?fù)u床1h。用TBST清洗3次，每次5 min，棄去清洗液。ECL試劑盒顯色，X膠片定影。采用GAPDH蛋白內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用±S表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

未姜黃素處理細(xì)胞的 NF－κB、磷酸化c－jun和bcl-2蛋白質(zhì)水平比較高，p53蛋白水平低，說(shuō)明細(xì)胞凋亡水平低，而NF-κB信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路活性高。P-gp是mdr1基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，其水平高，說(shuō)明存在較高的細(xì)胞多耐藥。姜黃素作用后，NF-κB、磷酸c-jun、bcl-2蛋白水平顯著下降，說(shuō)明NF－κB、JNK信號(hào)通路明顯受到抑制。此外，p53蛋白水平顯著升高，說(shuō)明細(xì)胞凋亡增加。P-gp水平顯著降低，則細(xì)胞多耐藥性顯著減小。相應(yīng)的灰度值見(jiàn)表2。

表2 各分子相對(duì)GAPDH的blot灰度值（48h，%）

LNCaP細(xì)胞48h生長(zhǎng)率約為92%。不同濃度姜黃素作用后，細(xì)胞48h生長(zhǎng)率顯著下降，分別是變成30%、17%、3%。

3 討論

腫瘤MDR能夠抵抗臨床藥物的抗腫瘤作用，并且阻抑MDR腫瘤凋亡。本研究中，姜黃素作用于雄性激素依賴性前列腺癌 MDR細(xì)胞以后，NF-κB信號(hào)通路降低，mdr1／P-gp表達(dá)水平下降，bcl-2表達(dá)減少，c-Jun磷酸化減弱，而p53表達(dá)水平卻顯著升高，MDR細(xì)胞的凋亡顯著升高、MDR則顯著下降。相應(yīng)的，細(xì)胞生長(zhǎng)也受到顯著抑制。

前列腺癌細(xì)胞耐凋亡與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)。本研究中，雄性激素依賴性前列腺癌MDR細(xì)胞經(jīng)過(guò)姜黃素的作用，NF-κB信號(hào)通路受到顯著抑制，級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致磷酸c－jun水平顯著下降，抑制JNK信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)減低也造成了mdr1／P-gp表達(dá)的顯著降低［7］，腫瘤 MDR逆轉(zhuǎn)成為藥物敏感。

細(xì)胞凋亡過(guò)程復(fù)雜，包括多個(gè)基因的調(diào)控［11］。前列腺癌細(xì)胞表達(dá)p53、bcl-2和c-jun，其中p53上調(diào)指示細(xì)胞凋亡啟動(dòng)，并且p53對(duì)于NF－κB存在相反關(guān)聯(lián)的效應(yīng)。NF-κB信號(hào)可以通過(guò)上調(diào)下游bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)c-jun信號(hào)磷酸化激活JNK信號(hào)通路，抑制化療藥物誘導(dǎo)型細(xì)胞凋亡，最終細(xì)胞出現(xiàn)耐藥。在本研究中，姜黃素作用，減低了NF－κB信號(hào)，并導(dǎo)致下游bcl-2顯著下調(diào)，以及c－jun磷酸化水平減弱。作為相反關(guān)聯(lián)的凋亡蛋白p53表達(dá)則顯著增強(qiáng)，MDR前列腺癌細(xì)胞的抗凋亡作用顯著減弱并啟動(dòng)凋亡進(jìn)程，然后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。

總之，本研究結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞MDR可能與NF－κB信號(hào)介導(dǎo)的抗凋亡作用有關(guān)，因此，NF-κB信號(hào)可能作為前列腺癌治療的分子靶點(diǎn)。并且，姜黃素作用于MDR前列腺癌細(xì)胞，抑制NF－κB信號(hào)，下調(diào)bcl-2和磷酸化c－jun水平，抑制抗凋亡基因，減小癌細(xì)胞MDR，因此，姜黃素有可能治療MDR前列腺癌。

［1］Kolev，Tsonko M.DFT and Experimental Studies of the Structure and Vibrational Spectra of Curcumin［J］.International Journal of Quantum Chemistry.Wiley Periodicals.2005，102（6）：1069.

［2］Srivastava，KC；Bordia A；Verma SK.Curcumin，a major component of the food spice turmeric（Curcuma longa），inhibits aggregation and alters eicosanoid metabolism in human blood platelets［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1995，52 （4）：223.

［3］韓 婷，宓鶴鳴.姜黃的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào).2001，17（2）.

［4］Aggarwal，BB.；Shishodia S..Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer［J］.Biochemical Pharmacology.Elsevier.May 2006，71（10）：1397.

［5］Choi，Hyunsung.Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator：A Mechanism of Tumor Growth Inhibition［J］.American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics.July 2006，70：1664.

［6］張宇紅，李海民.核轉(zhuǎn)錄因子κB與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊(cè)2004，31（2）：95.

［7］王 漪，劉 心，張海濤，等.白血病細(xì)胞中NF-κB調(diào)控 MDR1基因、P糖蛋白及逆轉(zhuǎn)耐藥的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2007，15（5）：950.

［8］于小玲，孫向榮，葉俊麗.器官局限性前列腺癌中 NF-κB和IL-12的表達(dá)［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2004，27（4）：319.

［9］趙 川，韓 丹，楊 友，金樹(shù)珍.Bcl-2和P53蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)及其意義［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2006，（4）：72.

［10］潘玉琢，趙燕穎，趙雪儉，李 揚(yáng).人前列腺癌多藥耐藥細(xì)胞系的建立［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）.2007，33（4）：651.

［11］Liang CZ，Zhang JK，Shi Z，Liu B，Shen CQ，Tao HM.Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo through the upregulation of Bax and Fas／FasL and downregulation of Bcl-2［J］.Cancer Chemother Pharmacol.2012Feb；69（2）：317.

1007－4287（2012）10－1920－02

2011－08－17）