• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    IPaH-1基因在志賀氏菌表達的檢測及PCR條件的優(yōu)化

    2012-11-05 09:23:04羅雁非張曉靜李洪軍何成彥趙麗純
    中國實驗診斷學(xué) 2012年10期
    關(guān)鍵詞:賀氏埃希氏大腸

    羅雁非,丁 旭,文 雪,張曉靜,李洪軍,何成彥,趙麗純*

    (1.吉林出入境檢驗檢疫局,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春130021:3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

    志賀氏菌(Shigella)又稱痢疾桿菌,是一類以引起腹瀉癥狀為主的常見致病菌,據(jù) WHO報道,世界上每年有1.65億感染志賀氏菌,年死亡人數(shù)達110萬,99%發(fā)病人數(shù)在發(fā)展中國家,尤其是衛(wèi)生條件差的地區(qū),以5歲以下的兒童為主[1]。多種致病菌導(dǎo)致的腸道傳染病嚴重威脅著人類健康。致病菌的實驗室金標準鑒定手段仍然是培養(yǎng)、血清學(xué)和生化等傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢測方法,步驟相對繁瑣,一般需要數(shù)天才能得到結(jié)果,給檢驗帶來不便。因此建立快速、準確、靈敏的致病菌檢測方法對此類傳染病的早期判定至關(guān)重要。近年來,PCR和核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用,促進了細菌檢測技術(shù)的發(fā)展[2]。侵襲性質(zhì)??乖璈基因(invasion plasmid antigen H,ipaH,IPaH)是同時存在于痢疾桿菌染色體和侵襲性大質(zhì)粒上的侵襲基因。通過分子生物學(xué)方法檢測IPaH基因,可以快速檢測腹瀉患者糞中的痢疾桿菌,且在發(fā)病率評估上比細菌培養(yǎng)法靈敏準確[3-5]。但目前未見通過PCR法全面系統(tǒng)檢測IPaH1基因在鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌(O157:H7)、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等常見致病菌中的表達的報道。因此本研究檢測了IPaH1基因在志賀氏菌等幾種常見腸道致病菌中的表達,以確定IPaH1基因在志賀氏菌表達的特異性,為進一步進行ipaH1基因液態(tài)芯片的研究奠定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種及來源

    實驗所用標準菌株及其來源見表1。

    表1 菌種及來源

    標準株均采購于北京中原公司,分離株來自吉林出入境檢驗檢疫局微生物實驗室。

    1.2 主要試劑和儀器

    LB培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)、氯化鈉蔗糖培養(yǎng)基、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂(SPS)(液體硫乙醇酸鈉等購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司、Wizard○RGenomic DNA Purification Kit 試 劑 盒(Promega)、2×Easy Taq PCR SuperMix、瓊脂糖、100bp DNA Ladder Marker(大連寶生物)、DL2000 DNA Ladd er Marker(大連寶生物)等。

    恒溫培養(yǎng)箱(德國Binder)、水浴箱(美國Shellab)、PCR儀(美國 ABI)、電泳儀(PS500A)、Alphalmager EC紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Alpha)等。

    1.3 引物

    根據(jù)GenBank上IPaH-1基因序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2對引物,以16srRNA作為內(nèi)參基因。由上海捷瑞生物工程公司合成,序列如表2。

    表2 引物序列

    1.4 菌株的培養(yǎng)

    鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌(O157:H7)、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌用LA平板,糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌用TSA平板,37℃溫箱過夜培養(yǎng),然后挑取單菌落接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基,37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜;副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃溫箱過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到氯化鈉結(jié)晶紫增菌液,37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜;產(chǎn)氣莢膜梭菌用SPS平板37℃厭氧培養(yǎng)24-48h,然后挑取黑色單菌落于液體硫乙醇酸鈉中37℃過夜培養(yǎng)。

    1.5 細菌基因組DNA的提取

    按照 Promega Wizard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒使用說明操作,簡述如下:取1ml過夜培養(yǎng)物至1.5ml離心管中;13,000r/mim 離心2min收集菌體;加入600μl核裂解液重懸菌體;80℃ 孵育5min裂解細胞,冷卻至室溫;加入3μl RNA酶溶液,顛倒5次;37℃孵育35min,冷卻至室溫;加入200μl蛋白沉淀液,劇烈振蕩20s,冰上孵育5min;13,000r/mim離心3min;移上清至一離心管中,加入600μl異丙醇;輕輕顛倒混勻;13,000 r/mim離心2min;棄上清;加入600μl 70%乙醇,輕柔顛倒離心管數(shù)次;13,000r/mim 離心2min。小心吸去乙醇,將離心管倒置在干凈的吸水紙上,自然干燥15min;加入100μl DNA溶解液,4℃ 孵育過夜后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 PCR擴增目的基因

    PCR反應(yīng)體系(25μl):2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5μl;上、下游引物(10μM)各0.5μl;基因組DNA 模板1ng/μl 1μl;無菌水定容至25μl。循環(huán)參數(shù):95℃ 2min;94℃ 45sec、52℃ 30sec、72℃30sec,30個循環(huán);72℃ 延伸5min。

    1.7 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

    1.7.1 退火溫度優(yōu)化:PCR體系中各成分濃度不變,反應(yīng)程序,退火溫度依次為49.0℃,50.0℃,51.0℃,52.0℃,53.0℃,54.0℃,55.0℃,56.0℃,57.0℃,58.0℃,59.0℃。

    1.7.2 引物濃度優(yōu)化:PCR反應(yīng)體系為25μL,反應(yīng)程序不變,其他成分濃度不變,引物終濃度依次為0.02μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 IPaH1在幾種腸道致病菌的表達

    以鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希菌、出血性大腸埃希氏菌(O157:H7)、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等基因組DNA為模板進行PCR,結(jié)果可見IPaH1-1、IPaH1-2兩對引物均在志賀氏菌擴增出較高表達水平的目的條帶,片段長度與預(yù)期一致,其他11種菌均為陰性,見圖1A、B。

    A:引物為IPaH1-1;B:引物為IPaH1-2;M:DL 2000Marker;1-14的模板依次為:志賀氏菌ATCC 9207,志賀氏菌JL 08036,大腸埃希菌,出血性大腸埃希氏菌(O157:H7),腸炎沙門氏菌,阪崎腸桿菌,普通變形桿菌,蠟樣芽孢桿菌,糞腸球菌,金黃色葡萄球菌,單核細胞增生李斯特菌,副溶血性弧菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌,空白對照

    2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

    以鮑氏志賀氏菌基因組DNA為模板,對退火溫度、引物濃度及模板濃度等PCR反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。

    2.2.1 退火溫度的優(yōu)化

    結(jié)果顯示,引物IPaH1-1在55.0℃-59.0℃退火溫度下,擴增產(chǎn)物條帶均很清晰,表明該反應(yīng)體系的最佳退火溫度在55.0℃-59.0℃之間;引物IPaH1-2在51.0℃-55.0℃條帶均很清晰,說明該反應(yīng)體系的最佳退火溫度在51.0℃-55.0℃之間;如圖2、3所示。以下實驗反應(yīng)中以56℃為引物IPaH1-1的退火溫度,以52℃為引物IPaH1-2的退火溫度。

    圖2 退火溫度對IPaH1基因擴增的影響引物(引物為IPaH1-1)

    圖3 退火溫度對IPaH1基因擴增的影響引物(引物為IPaH1-2)

    2.2.2 引物濃度的優(yōu)化

    結(jié)果顯示,引物IPaH1-1、IPaH1-2終濃度為0.1μM時擴增條帶已經(jīng)很清晰,圖4。

    圖4 引物濃度對IPaH1基因擴增的影響

    3 討論

    志賀氏菌引起腸道傳染病發(fā)病率位居法定傳染病之首,嚴重危害人們的身體健康,因此建立比傳統(tǒng)檢測方法更快速、準確、實用的檢測方法尤為重要[6]。近年來,建立了一些新的檢測方法,如PCR檢測技術(shù)和基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)檢測技術(shù)。這些檢測技術(shù)在很大程度上依賴于PCR擴增,特別是多重PCR,對于引物的要求更高。我們設(shè)計引物時,根據(jù)志賀氏菌毒力基因表達產(chǎn)物侵襲性質(zhì)??乖?H基因(ipaH)、侵襲相關(guān)基因(ial)、志賀菌腸毒素1基因(ShET-1)和志賀菌腸毒素2基因(ShET-2)[7,8]。但志賀氏菌同許多病原菌一樣都存在毒力相關(guān)基因也稱毒力島[9],這對志賀氏菌特異性引物的設(shè)計增加了難度。

    1987年Buysse等[10]發(fā)現(xiàn)IPaH以多拷貝同時存在于各型志賀氏菌染色體和侵襲性大質(zhì)粒上,不隨傳代而丟失。以IPaH設(shè)計引物建立PCR檢測方法具有較高敏感性并可避免因基因突變、質(zhì)粒丟失而導(dǎo)致的假陰性。已有研究以IPaH基因擴增為基礎(chǔ)進行了IPaH4.5的功能研究[11]。本文根據(jù)引物設(shè)計原則和相關(guān)信息設(shè)計了包括管家基因在內(nèi)的七對引物(未全部列出),從中篩選出符合分子生物學(xué)檢測志賀氏菌IPaH1基因表達,具較高特異性的兩對引物,在大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌(O157:H7)、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌未見表達;并從退火溫度、引物濃度方面對PCR反應(yīng)條件進行了優(yōu)化,兩對引物理想終濃度均為0.1μM,最適退火溫度分別為55.0℃-59.0℃、51.0℃-55.0℃。本研究結(jié)果為進一步建立IPaH1基因液態(tài)芯片檢測系統(tǒng)奠定了實驗基礎(chǔ)。

    [1]Golovliov I,Sjstedt A,Mokrievich A,Pavlov V.A method for allelic replacement in Francisella tularensis [J].FEMS Microbiol Lett,2003,222(2):273.

    [2]邵 暉,吳玲玲,王 偉,等.食品中病原微生物檢測方法進展及優(yōu)缺點評價[J].中國食品工業(yè),2008,23(4):40.

    [3]李小麗,陰赪宏,溫 艷,等.PCR快速檢測腹瀉患者糞中痢疾桿菌致病基因ipaH和iaI[J].世界華人消化雜志,2007,15(19):2128.

    [4]李智瓊,鄧尚廉,孫承謀.用檢測ipaH基因的PCR檢測志賀菌屬[J].臨床檢驗雜志,2009,27(3):185.

    [5]王松梅,郝志勇,馬景臣,等.PCR檢測與細菌培養(yǎng)方法在細菌性痢疾監(jiān)測中的應(yīng)用比較[J].復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,33(6):766.

    [6]趙麗華,周 勇,萬成松.分子信標PCR檢測志賀菌ipaH基因[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2006,6(5):499.

    [7]Fasano A,Noriega FR,Maneval DR Jr,et al.Shigella enterotoxin 1:an enterotoxin of Shigella flexneri 2aactive in rabbit small intestine in vivo and in vitro[J].J Clin Invest,1995,95(6):2853.

    [8]Venkatesan MM,JM Buysee,DJ Kopecko,et al.Use of Shigella flexneri ipaC and ipaH gene sequences for the general identification of Shigella spp.and enteroinvasive Escherichia coli[J].J Clin Microbiol,1989,27(12):2687.

    [9]龍北國,江麗芳.高級醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003.10.

    [10]Buysse J M,Stover CK,Oaks EV,et al.Molecular cloning of invasion plasmid antigen(ipa)genes from Shigella flexneri analysis of ipagene products and genetic mapping[J].J Bacteriol,1987,169(6):2561.

    [11]王 芳,馬紅芳,何 湘,等.福氏志賀菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子IpaH4.5功能的初步研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2009,33(2):120.

    猜你喜歡
    賀氏埃希氏大腸
    埃希氏菌的遺傳演化關(guān)系分析
    食品中大腸埃希氏菌O26血清型檢測方法的建立
    大腸鏡檢陰性慢性腹瀉與末端回腸病變的關(guān)系分析與探討
    鹽酸克倫特羅生物素化單鏈抗體在大腸埃希氏菌中的表達
    賀氏源頭考
    尋根(2016年3期)2016-06-28 06:20:36
    大口喝水促排便
    拼搏之后的賀氏孤兒:聯(lián)想曾力圖存亡續(xù)絕
    大腸俞穴調(diào)理腸胃大腸俞 通絡(luò)調(diào)水止病痛
    中老年健康(2014年7期)2014-05-30 09:01:27
    無貞潔,吾寧死
    百家講壇(2014年17期)2014-02-11 11:52:28
    2010~2012年漢中地區(qū)大腸埃希氏菌耐藥性分析
    午夜福利,免费看| av在线播放精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 人妻一区二区av| 老汉色∧v一级毛片| 国产片内射在线| 一区二区三区精品91| 久久婷婷青草| 国产成人aa在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 中文天堂在线官网| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 午夜影院在线不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲av男天堂| 国产极品天堂在线| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲图色成人| 亚洲国产欧美网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产免费又黄又爽又色| 日本欧美国产在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品久久久精品久久久| 日韩伦理黄色片| 叶爱在线成人免费视频播放| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久久久免费视频了| 一级毛片 在线播放| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲成人手机| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 色网站视频免费| 在线观看免费视频网站a站| 婷婷成人精品国产| 大片免费播放器 马上看| 亚洲综合色网址| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人精品在线电影| 成年女人在线观看亚洲视频| 久热久热在线精品观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产免费现黄频在线看| 国产精品久久久av美女十八| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产成人免费无遮挡视频| 日日撸夜夜添| 天天操日日干夜夜撸| 热99久久久久精品小说推荐| 性色av一级| 欧美精品av麻豆av| 人成视频在线观看免费观看| 国产午夜精品一二区理论片| 黄色视频在线播放观看不卡| 色吧在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 乱人伦中国视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 国产成人aa在线观看| 久久 成人 亚洲| 丰满乱子伦码专区| 男的添女的下面高潮视频| av有码第一页| 九九爱精品视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲精品美女久久av网站| 国产亚洲一区二区精品| 两性夫妻黄色片| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 啦啦啦啦在线视频资源| 久久国产亚洲av麻豆专区| 最近最新中文字幕免费大全7| 天堂中文最新版在线下载| 99re6热这里在线精品视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品国产三级国产专区5o| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 色婷婷av一区二区三区视频| 男的添女的下面高潮视频| 国产av码专区亚洲av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久热久热在线精品观看| 黄色视频在线播放观看不卡| av电影中文网址| 国产综合精华液| 亚洲综合色网址| xxx大片免费视频| 日日撸夜夜添| 女人精品久久久久毛片| 国产极品天堂在线| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜福利视频精品| 丰满乱子伦码专区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 永久网站在线| 国产片特级美女逼逼视频| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品日本国产第一区| 青春草亚洲视频在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品无大码| 黑丝袜美女国产一区| 美女午夜性视频免费| 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产精品成人久久小说| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人亚洲精品一区在线观看| 伦精品一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 另类精品久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 搡女人真爽免费视频火全软件| 1024视频免费在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 看免费成人av毛片| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 免费日韩欧美在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 最新中文字幕久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 美女主播在线视频| 亚洲天堂av无毛| 麻豆av在线久日| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 大香蕉久久网| 国产不卡av网站在线观看| 精品人妻在线不人妻| 国产亚洲精品第一综合不卡| 新久久久久国产一级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产xxxxx性猛交| 日韩一区二区视频免费看| 人妻 亚洲 视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久婷婷青草| 在线观看免费视频网站a站| 男人添女人高潮全过程视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产深夜福利视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 一区二区三区激情视频| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久网色| 超碰成人久久| 美国免费a级毛片| av不卡在线播放| 久久精品国产综合久久久| 国产精品女同一区二区软件| 伦理电影免费视频| 欧美精品国产亚洲| 国产精品女同一区二区软件| 久久 成人 亚洲| 大片电影免费在线观看免费| 国产97色在线日韩免费| 69精品国产乱码久久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 五月开心婷婷网| 久久这里有精品视频免费| tube8黄色片| 18禁观看日本| 最近的中文字幕免费完整| 久久 成人 亚洲| 丰满迷人的少妇在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 人妻 亚洲 视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲图色成人| 丝袜在线中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 老熟女久久久| 丝袜喷水一区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美日本中文国产一区发布| 国产不卡av网站在线观看| 午夜福利,免费看| 成年人免费黄色播放视频| 90打野战视频偷拍视频| 国产有黄有色有爽视频| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲一码二码三码区别大吗| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 观看av在线不卡| 亚洲美女视频黄频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲内射少妇av| 在线观看国产h片| 久久午夜福利片| 欧美日韩av久久| 丝袜脚勾引网站| 亚洲成人一二三区av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av在线老鸭窝| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产毛片在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 2022亚洲国产成人精品| 一区在线观看完整版| 极品人妻少妇av视频| 久久久久久伊人网av| 看非洲黑人一级黄片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 久久精品夜色国产| 精品少妇内射三级| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 69精品国产乱码久久久| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲av成人精品一二三区| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看国产h片| 我的亚洲天堂| av国产久精品久网站免费入址| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费看av在线观看网站| 精品亚洲成a人片在线观看| av视频免费观看在线观看| 久热这里只有精品99| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品不卡视频一区二区| 色94色欧美一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 美女主播在线视频| 在线观看国产h片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 2021少妇久久久久久久久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 丝袜在线中文字幕| 国产成人精品一,二区| 欧美+日韩+精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 大陆偷拍与自拍| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 女人精品久久久久毛片| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美精品免费久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品一二三| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| xxx大片免费视频| 日本爱情动作片www.在线观看| www日本在线高清视频| 热re99久久精品国产66热6| a级片在线免费高清观看视频| 色94色欧美一区二区| 熟女电影av网| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产激情久久老熟女| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产一区二区激情短视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 99香蕉大伊视频| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 麻豆国产av国片精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 免费av中文字幕在线| 在线观看舔阴道视频| 激情在线观看视频在线高清| 神马国产精品三级电影在线观看 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产乱人伦免费视频| 亚洲伊人色综图| 精品国产美女av久久久久小说| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲国产欧美一区二区综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 我的亚洲天堂| 黄色成人免费大全| 97碰自拍视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 1024香蕉在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| bbb黄色大片| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 亚洲全国av大片| 亚洲第一青青草原| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩有码中文字幕| 久久影院123| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 人人澡人人妻人| 香蕉久久夜色| 热re99久久精品国产66热6| 在线永久观看黄色视频| 91av网站免费观看| 香蕉国产在线看| 免费不卡黄色视频| 在线播放国产精品三级| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 两性夫妻黄色片| 99久久综合精品五月天人人| 欧美乱码精品一区二区三区| 91字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久久久精品吃奶| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费av中文字幕在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 看片在线看免费视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲成av片中文字幕在线观看| a级毛片在线看网站| 日本wwww免费看| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美日韩黄片免| 亚洲视频免费观看视频| 黄色视频不卡| 国产成人影院久久av| 狂野欧美激情性xxxx| 热re99久久国产66热| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 另类亚洲欧美激情| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女午夜视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 香蕉国产在线看| 夜夜夜夜夜久久久久| 级片在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲男人天堂网一区| 久久久久国内视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精华国产精华精| 一级作爱视频免费观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | av免费在线观看网站| 欧美在线黄色| 日本三级黄在线观看| 9191精品国产免费久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 天天影视国产精品| 久久中文字幕一级| 国产麻豆69| 成人精品一区二区免费| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 99国产极品粉嫩在线观看| 十八禁网站免费在线| 国产av又大| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av美国av| 三级毛片av免费| 成人永久免费在线观看视频| 宅男免费午夜| tocl精华| 中文字幕高清在线视频| 精品人妻1区二区| 久久中文字幕人妻熟女| 国产97色在线日韩免费| 欧美性长视频在线观看| 国产不卡一卡二| 免费搜索国产男女视频| 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品91蜜桃| videosex国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 操美女的视频在线观看| 色播在线永久视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产成人精品无人区| 99久久综合精品五月天人人| av免费在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产99久久九九免费精品| 老司机靠b影院| 90打野战视频偷拍视频| 大码成人一级视频| 亚洲欧美激情在线| 国产一区二区在线av高清观看| 日本wwww免费看| 午夜福利影视在线免费观看| 美女午夜性视频免费| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜福利,免费看| 99国产综合亚洲精品| 香蕉丝袜av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲第一青青草原| 操出白浆在线播放| 国产免费男女视频| 18禁国产床啪视频网站| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 美女大奶头视频| 日韩高清综合在线| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产成人系列免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 天堂影院成人在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| videosex国产| 人妻久久中文字幕网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产片内射在线| 自线自在国产av| 母亲3免费完整高清在线观看| 脱女人内裤的视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一边摸一边抽搐一进一小说| 麻豆一二三区av精品| 丁香欧美五月| 男人的好看免费观看在线视频 | √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成人久久性| 久久人妻熟女aⅴ| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| av天堂在线播放| 亚洲黑人精品在线| 日日爽夜夜爽网站| 精品一品国产午夜福利视频| tocl精华| 一级黄色大片毛片| 亚洲人成77777在线视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 不卡一级毛片| av在线天堂中文字幕 | 丁香六月欧美| 91成人精品电影| 成年人黄色毛片网站| 老司机亚洲免费影院| 91精品三级在线观看| 成人三级做爰电影| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 久久青草综合色| 在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 女性被躁到高潮视频| 在线天堂中文资源库| 宅男免费午夜| 少妇的丰满在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 日韩av在线大香蕉| 一级毛片高清免费大全| 在线永久观看黄色视频| 国产97色在线日韩免费| 日本免费一区二区三区高清不卡 | av在线天堂中文字幕 | 亚洲成人免费电影在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一级a爱片免费观看的视频| 69精品国产乱码久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产野战对白在线观看| 一级作爱视频免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 国产av精品麻豆| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产一区在线观看成人免费| 久久香蕉激情| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品永久免费网站| 午夜精品国产一区二区电影| 免费看十八禁软件| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一区二区在线av高清观看| svipshipincom国产片| 村上凉子中文字幕在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 少妇 在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲国产欧美网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 男女午夜视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩精品网址| 免费高清在线观看日韩| 日日夜夜操网爽| 久久天堂一区二区三区四区| 女人被狂操c到高潮| 日韩精品青青久久久久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产有黄有色有爽视频| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲av美国av| www.精华液| 两个人免费观看高清视频| 久久这里只有精品19| 亚洲成人久久性| 91国产中文字幕| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲黑人精品在线| www日本在线高清视频| 久久精品影院6| 两个人看的免费小视频| 另类亚洲欧美激情| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日本wwww免费看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 一区二区三区国产精品乱码| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久天堂一区二区三区四区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 涩涩av久久男人的天堂| 精品国产一区二区久久| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 欧美乱色亚洲激情| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲avbb在线观看| 国产野战对白在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 丝袜在线中文字幕| 制服诱惑二区| 午夜两性在线视频| 亚洲五月天丁香| 看黄色毛片网站| 精品一品国产午夜福利视频| 桃色一区二区三区在线观看| 乱人伦中国视频| 精品久久久久久电影网| 欧美一区二区精品小视频在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 高清在线国产一区| 午夜a级毛片| 免费在线观看亚洲国产| 97人妻天天添夜夜摸| 久久中文字幕一级| 咕卡用的链子| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产激情欧美一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费观看精品视频网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久影院123| 宅男免费午夜| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品国产美女av久久久久小说|