MALDI質(zhì)譜成像的樣本制備技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

徐 靜，萬家余，許 娜，許 琴，李 楠，王景龍，劉文森

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130122）

MALDI質(zhì)譜成像的樣本制備技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

徐 靜，萬家余，許 娜，許 琴，李 楠，王景龍，劉文森＊

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130122）

＊通訊作者

MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)（Maldi tof Imaging Mass Spectrometry，MALDI-IMS），是利用 MALDI質(zhì)譜技術(shù)將得到的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助成像產(chǎn)生分子圖像，進(jìn)而描繪出組織上已知及未知分子分布情況的新技術(shù)。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的很多領(lǐng)域，如動植物生理學(xué)、病理學(xué)［1－3］、藥物研發(fā)［4－6］等。

1 樣品制備技術(shù)

MALDI質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是樣品的制備［7］，它主要包括冰凍切片的制備和基質(zhì)的選擇及應(yīng)用等。

1.1 冰凍切片的制備冰凍切片的制備是一項(xiàng)比較成熟的技術(shù)，但為了保證質(zhì)譜成像結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，在質(zhì)譜成像技術(shù)應(yīng)用范圍不斷得到拓展的同時，組織樣品的儲存、包埋以及切片厚度選擇等方面也得到了不斷的優(yōu)化和改進(jìn)。對于組織樣品的儲存，過去多推薦采用液氮快速冷凍后儲存于－80℃的方法，但新鮮組織放置于液氮中其內(nèi)部會因受冷不均勻而導(dǎo)致組織裂開，常常影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。Goodwin等［8］使用－70℃或更低溫度的乙醇或異丙醇代替液氮，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)證明該方法在避免凍存組織裂開方面效果顯著。冷凍切片制備過程中包埋劑的選擇也值得關(guān)注，對于普遍使用的包埋劑OCT（Optimal cutting temperature polymer），由于其易離子化而使質(zhì)譜信號強(qiáng)度下降，所以應(yīng)盡量避免使用OCT包埋劑或使用OCT時避免污染樣本，現(xiàn)在多采用冰或聚合樹脂代替OCT來作為包埋劑［9］。切片的厚度對于MALDI-IMS實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，切片不易過厚，因?yàn)楹袂衅幸恍﹄x子信號有干擾的物質(zhì)不易被乙醇充分清洗掉，另外，切片越厚其表面覆蓋基質(zhì)之后，相對于MALDI導(dǎo)電玻片的絕緣性就越強(qiáng)，所以薄切片具有較低的電荷效應(yīng)，3－5μm厚度的冰凍切片易于得到質(zhì)量較好的質(zhì)譜圖，尤其適合檢測m／z較大分子［10］。

1.2 基質(zhì)的選擇及應(yīng)用高質(zhì)量的 MALDI-IMS圖像從根本上依賴于高效的基質(zhì)對分析物的沉淀。高效的基質(zhì)可以從樣品中最大程度的抽提出分析物，同時限制分析物的擴(kuò)散，且能夠產(chǎn)生比MALDI分辨率更小的結(jié)晶，MALDI-TOF的空間分辨率一般為25－50μm。MALDI-IMS實(shí)驗(yàn)中常從選擇恰當(dāng)?shù)幕|(zhì)（表1）［11］及濃度，挑選合適的溶劑組分，使用高效的基質(zhì)覆蓋方法方面來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。合適的基質(zhì)溶劑應(yīng)既能將組織切片濕透、充分溶出分析物，同時又能快速干燥，有效避免樣品的遷移現(xiàn)象?；|(zhì)的覆蓋方法原則上有兩種，噴霧法和點(diǎn)樣法。比較兩種方法，噴霧法在噴霧和干燥循環(huán)交替進(jìn)行時易引起切片表面過濕，導(dǎo)致組織切片上分析物的位置遷移，另外基質(zhì)結(jié)晶的尺寸和同質(zhì)性也容易因?yàn)椴僮鞑煌苡绊憽｜c(diǎn)樣法產(chǎn)生的基質(zhì)液滴體積為80－150pL，可形成直徑為100－200μm的圓形基質(zhì)結(jié)晶區(qū)域，其在一定程度上限制了分析物的空間位置遷移，但圖像分辨率易受到基質(zhì)斑的直徑和間距的影響。

具體在實(shí)驗(yàn)中，要結(jié)合分析物性質(zhì)來選擇。大量的實(shí)驗(yàn)圍繞基質(zhì)的選擇及運(yùn)用方法的優(yōu)化展開，取得了很多寶貴的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。此外，針對不同種類的研究對象，在基質(zhì)應(yīng)用方面科學(xué)家們進(jìn)行了一些有益的探索值得借鑒，如Satu M.Puolitaival1等［12］實(shí)驗(yàn)證明利用升華作用得到的基質(zhì)層沉淀均勻，不易發(fā)生分析物空間位置遷移現(xiàn)象，特別適用于組織內(nèi)磷脂分子成像。Ruibing Chen等［13］通過調(diào)整基質(zhì)噴灑器的噴口與MALDI樣品靶之間的距離和噴射基質(zhì)溶液的流速，產(chǎn)生相對干和濕兩種基質(zhì)覆蓋狀態(tài)，分別采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)后比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于分子量小于900Da的脂類，這兩種基質(zhì)覆蓋狀態(tài)下所得到的質(zhì)譜信號強(qiáng)度和峰型基本沒有差別。

2 MALDI質(zhì)譜成像在生命科學(xué)領(lǐng)域最新研究成果

2.1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用MALDI質(zhì)譜成像作為提供唯一全面的組織內(nèi)分子分布信息的技術(shù)，已成為科學(xué)家研究生命體內(nèi)各種生理和病理過程分子機(jī)制的最有力的手段。Vladimir等［14］利用MALDI質(zhì)譜成像得到飽和烴、不飽和烴（HCs）和蠟酯（WEs）在灰色麻蠅的翅膀和腿部、普通果蠅翅膀以及椰棗樹葉表面的分布圖像，建立了在昆蟲及植物角質(zhì)層表面直接進(jìn)行脂類和烴類化合物分子成像的實(shí)驗(yàn)方法，該方法正被應(yīng)用于果蠅體表化學(xué)信息的研究中。

表1 常用的基質(zhì)及應(yīng)用范圍

Stephanie S.DeKe 等［15］利 用 MALDI-TOFTOF，進(jìn)行甲殼類動物神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)肽的分子成像實(shí)驗(yàn)，得到了兩種蟹（Jona h crab和cancer borealis）的腦和心包器官內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)輔助成分的分子分布圖像，建立了質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)中復(fù)雜多樣的內(nèi)源性信號分子的樣品制備方法。這種器官水平的質(zhì)譜成像研究將有助于闡明同一神經(jīng)肽家族內(nèi)部不同神經(jīng)肽亞型間的空間分布關(guān)系，以及不同神經(jīng)肽家族之間的相對分布關(guān)系。

Yuki Sugiura等［16］利用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)闡明了不同神經(jīng)節(jié)苷脂分子的分布，尤其探明了按照神經(jīng)鞘氨醇含碳原子數(shù)目分類的C18－神經(jīng)節(jié)糖苷和C20-神經(jīng)節(jié)糖苷的分布差異，前者廣泛的分布在前腦部位，后者選擇性的沿內(nèi)嗅區(qū)到海馬投影區(qū)分布，尤其在齒狀回（DG）分子層分布較多。該實(shí)驗(yàn)首次證明了神經(jīng)節(jié)苷脂在腦內(nèi)分布的選擇性，并推測這種選擇性與不同區(qū)域表達(dá)的神經(jīng)節(jié)糖苷的功能差異有關(guān)。

2.2 藥物研發(fā)中的應(yīng)用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)在藥物研發(fā)方面有著廣泛的應(yīng)用前景，如可用于藥物靶向篩選、組織器官或細(xì)胞內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物分布等方面研究。Végvári等［17］設(shè)計(jì)了一種內(nèi)置于壓力調(diào)控微芯片上的微量分配器平臺系統(tǒng)，其可耐受多種有機(jī)溶劑，最小可沉淀體積為100pL的基質(zhì)液滴，并可通過軟件嘗試多種基質(zhì)沉淀策略?；谠摶|(zhì)覆蓋技術(shù)的MALDI質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)，在肺組織切片中成功檢測到了治療肺慢性阻塞性疾病（COPD）的藥物Tiotropium的兩個二級離子信號，分別是152.1和170.1Da，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該技術(shù)沉淀基質(zhì)的重復(fù)性好，能形成指定厚度的基質(zhì)層，非常適用于小分子藥物的研究。

2.3 疾病早期診斷中的應(yīng)用MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)在尋找疾病生物標(biāo)記物、研發(fā)疾病早期診斷方法等方面具有其他技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢，已逐漸成為該領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。Shuichi Shimma等［18］利用MALDI-IMS技術(shù)尋找人類結(jié)腸癌疾病的生物標(biāo)記物，由于磷脂在細(xì)胞膜組分中發(fā)揮重要的作用，所以將其作為重要檢測目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)最終發(fā)現(xiàn)兩種磷脂分子存在明顯的表達(dá)差異，并使用MS／MS技術(shù)進(jìn)行了鑒定，可作為該病潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

A.F.Maarten Altelaar等［19］利用 MALDI質(zhì)譜成像進(jìn)行了大白鼠、小白鼠及人腦垂體內(nèi)神經(jīng)肽的序列差異分析，由于垂體切片?。ㄖ睆?02－103 μm），實(shí)驗(yàn)中將 MALDI-IMS技術(shù)分別與離子顯微鏡和 TIC（total-ion-count）成像技術(shù)結(jié)合使用，得到500nm的像素點(diǎn)和4μm的空間分辨率，彌補(bǔ)了MALDI-IMS分辨率相對較低的弱點(diǎn)。這一技術(shù)可用于尋找正常組織病變后小肽或蛋白質(zhì)發(fā)生的氨基酸序列異常變化（如：氨基酸置換、翻譯后修飾改變等），這將對于疾病的快速診斷具有重要意義。

Siddharth S.Samsi等［20］提出了一種區(qū)分濾泡性淋巴瘤的類別的系統(tǒng)化實(shí)驗(yàn)方法，將甲醛固定石蠟包埋的組織塊，切成5μm厚的切片，進(jìn)行切片原位酶解后 MALDI質(zhì)譜成像分析，同時進(jìn)行H＆E染色分析，再將質(zhì)譜成像得到的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合組織形態(tài)學(xué)，有望發(fā)展一種新的診斷工具，即通過MALDI質(zhì)譜成像區(qū)分濾泡、套膜、濾泡內(nèi)區(qū)域，進(jìn)而更加準(zhǔn)確的對濾泡性淋巴瘤進(jìn)行診斷和分類。

3 結(jié)語

MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)發(fā)展迅速，與其他成像技術(shù)相比存在顯著優(yōu)勢。首先，其所得到的質(zhì)荷比（m／z）信息是以分子的原子組成為基礎(chǔ)，是已被普遍采用的參數(shù)，該技術(shù)不需要對分析物進(jìn)行標(biāo)記，便可對未知分子成像；其次，借助質(zhì)譜儀的高分辨率，還可以區(qū)分分子間的細(xì)微差別；第三，盡管次級離子質(zhì)譜（SIMS）的分辨率可達(dá)1μm，明顯高于 MALDI，但SIMS質(zhì)量測量范圍明顯不及MALDI。另外，MALDI儀器的廣泛應(yīng)用，也是其快速發(fā)展的重要原因之一。

MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)作為快速、直觀的蛋白組學(xué)研究工具前景十分廣闊，但在具體實(shí)驗(yàn)中還存在很多技術(shù)上的難題。一方面，在研究藥物及其代謝產(chǎn)物組織內(nèi)分布方面，由于藥物分子在組織細(xì)胞內(nèi)含量低，對實(shí)驗(yàn)靈敏度要求較高，因此實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)選擇及應(yīng)用方法方面仍需要進(jìn)行較多的嘗試［21，22］。另一方面，利用質(zhì)譜成像技術(shù)篩選得到的未知蛋白質(zhì)的鑒定相對小肽的鑒定仍存在較多困難，使用顯微切割系統(tǒng)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的蛋白組學(xué)方法對組織切片上目的蛋白進(jìn)行鑒定，或者對組織切片原位酶解后利用二級質(zhì)譜方法對肽段進(jìn)行鑒定，均易受到組織上目的蛋白的彌散分布、蛋白水解過程或者目的蛋白豐度較低等因素的干擾，而很難得到令人滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，建立完善和成熟的 MALDI質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)方法仍然是這一技術(shù)優(yōu)勢得到充分發(fā)揮的前提和基礎(chǔ)。

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1007－4287（2012）10－1939－04

國家自然科學(xué)基金（30972197）

徐靜，31歲，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：瘋牛病發(fā)病機(jī)制研究。

2012－06－16）