葉酸靶向含硼脂質(zhì)體的制備及其包封率的測定

王志會，錢林學(xué)，劉 冬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050)

1 前言

硼中子俘獲治療(boron neutron capture therapy，BNCT)是一種安全、有效的二元化治療腫瘤的方法[1]。BNCT通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)的核反應(yīng)來摧毀癌細(xì)胞，通過口服或注射對乏氧腫瘤細(xì)胞和分裂間期細(xì)胞具有強(qiáng)親和力的攜帶劑10B，以中子射線對其進(jìn)行照射，中子與10B結(jié)合后發(fā)生核反應(yīng)，釋放出具有短程殺傷作用的α粒子和7Li粒子，從而殺死癌細(xì)胞[2]。在國外，該項技術(shù)在治療惡性腦膠質(zhì)瘤[3，4]、皮膚惡性黑色素瘤[5]等方面已經(jīng)取得了令人鼓舞的成果。將BNCT成功應(yīng)用于其他腫瘤治療的核心問題是如何使得含10B的藥物有選擇性地在腫瘤組織內(nèi)積聚。

脂質(zhì)體是靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，具有被動靶向性、緩釋性，組織親和性以及低毒性等特點，是一種很好的藥物靶向運(yùn)載工具[6]。葉酸受體大部分來源于上皮組織的惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌細(xì)胞中均有高度表達(dá)[7]。目前常用的硼攜帶劑是巰基十二硼烷二鈉鹽(BSH)和對二羥基硼酰苯丙氨酸(BPA)，且已有報道將BSH和BPA制備成脂質(zhì)體[8]，但其包封率均較低，不足20%。本實驗旨制備葉酸靶向的含硼脂質(zhì)體，并對其制備處方和工藝條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，為BNCT的研究與應(yīng)用提供一個有效的靶向給藥途徑。

2 儀器及試劑

實驗用到的儀器如下:AE200分析天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)，UV—2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)，LC—10A高效液相色譜儀(日本島津公司);AgilentHC—C18色譜 C18柱(5 μm ，250 mm × 4.6 mm)(日本島津公司)，XW—80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，RE—52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海振捷實驗設(shè)備有限公司)，GL—802A微型臺式真空泵(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，PHS—3D型pH計(上海精科)，Nano—ZS納米粒度及zeta電位分析儀(馬爾文，英國)，SK1200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，TGL—16G臺式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

實驗用到的試劑如下:Folic acid－PEG－DSPE(F－PEG－DSPE，Nanocs);氫化大豆卵磷脂(HSPC，Avanti);膽固醇(Chol，Avanti);三氯甲烷(北京化工廠)，經(jīng)CaH2回流、蒸餾干燥;葡聚糖凝膠G—25(Solarbio);4—羥基苯硼酸(HBA，北京普瑞東方化學(xué)技術(shù)有限公司)脂質(zhì)體、2—噻吩硼酸(TBA，北京普瑞東方化學(xué)技術(shù)有限公司)脂質(zhì)體;4—叔丁基苯硼酸(BBA，北京普瑞東方化學(xué)技術(shù)有限公司);甲醇(色譜純，DIKMA)。

3 方法及結(jié)果

3.1 HBA靶向脂質(zhì)體的制備

采用復(fù)乳法制備HBA靶向脂質(zhì)體，精確稱取不同量的Folic acid－PEG－DSPE、磷脂、膽固醇置于茄形瓶中，加入適量三氯甲烷，使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進(jìn)行真空減壓去除有機(jī)溶劑，使瓶壁上形成一層均勻的薄膜，然后加入一定量HBA溶液水化，渦旋振蕩數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入超聲波乳化器。超聲一段時間后，再次將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進(jìn)行真空減壓，即制得較均勻的HBA靶向脂質(zhì)體懸浮液。采用聚碳酸酯膜進(jìn)行擠壓，膜的孔徑分別為 0.8、0.4、0.2 μm，測平均粒徑為(135±10)nm，置于4℃保存。

3.2 TBA、BBA靶向脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備TBA、BBA靶向脂質(zhì)體，精確稱取不同量的Folic acid－PEG－DSPE、磷脂、膽固醇與TBA或BBA置于茄形瓶中，加入適量三氯甲烷，使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進(jìn)行真空減壓去除有機(jī)溶劑，使瓶壁上形成一層均勻的薄膜，然后加入一定量磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液水化，渦旋振蕩數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入超聲波乳化器，超聲一段時間即制得較均勻TBA或BBA靶向脂質(zhì)體懸浮液。采用聚碳酸酯膜進(jìn)行擠壓，膜的孔徑分別為 0.8、0.4、0.2 μm，測平均粒徑分別為(109±4)nm、(127±6)nm，置于4℃保存。

3.3 HBA、TBA、BBA最大吸收波長的測定

采用紫外分光光度法確定HBA、TBA、BBA的最大吸收波長。精密吸取1 mg/mL的HBA、TBA、BBA溶液 1 mL，定容至 50 mL，配成濃度為20 μg/m L的 HBA、TBA、BBA 溶液，置于石英吸收池中，以其溶劑為空白對照，在190～400 nm的波長范圍內(nèi)測定最大吸收波長，得出最大吸收波長分別為234、238、225 nm，如圖1 ～3 所示。

圖1 紫外分光光度法測定HBA的吸收曲線Fig.1 The absorption curve of HBA determinated by UV spectrophotometer

圖2 紫外分光光度法測定TBA的吸收曲線Fig.2 The absorption curve of TBA determinated by UV spectrophotometer

3.4 HBA、TBA、BBA 色譜條件的選擇

HBA含量測定高效液相色譜(HPLC)法的色譜條件選擇如下:色譜柱AgilentHC—C18，甲醇∶水=20∶80 為流動相，流速為 1.0 mL/min，紫外波長為234 nm，柱溫為28℃，進(jìn)樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以HBA計算理論塔板數(shù)為5350，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

圖3 紫外分光光度法測定BBA的吸收曲線Fig.3 The absorption curve of BBA determinated by UV spectrophotometer

TBA含量測定HPLC法的色譜條件選擇如下:色譜柱 AgilentHC—C18，甲醇∶水 =40∶60為流動相，流速為1.0 mL/min，紫外波長為238 nm，柱溫為28℃，進(jìn)樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以TBA計算理論塔板數(shù)為2581，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

BBA含量測定HPLC法的色譜條件選擇如下:色譜柱為AgilentHC—C18，甲醇∶水=78∶22為流動相，流速為1.0 mL/min，紫外波長為225 nm，柱溫為28℃，進(jìn)樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以BBA計算理論塔板數(shù)為3315，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

3.5 HBA、TBA、BBA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取 HBA對照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0 mL，分別置于5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，每次進(jìn)樣20 μL，記錄數(shù)據(jù)。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度(C，1 μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計算，回歸方程為A=96060C －3310.6，相關(guān)系數(shù) r=0.9999。結(jié)果表明，HBA在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

精確稱取TBA、BBA對照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0 mL，分別置5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，每次進(jìn)樣20 μL，記錄數(shù)據(jù)。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度(C，1 μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計算，回歸方程分別A=108018C －158413、A=86782C –20512，相關(guān)系數(shù)分別為 r=0.9983、r=0.9998。結(jié)果表明，TBA、BBA在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.6 含量的測定

精密吸取水化后 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體0.5 mL，置于 5 mL 離心管(EP)管中，加入 0.1 mL triton—10破乳，搖勻，作為供試液;并配制濃度為10 μg/mL的 HBA、TBA、BBA 作為對照品溶液，按外標(biāo)法計算出供試品中 HBA、TBA、BBA的含量。取上述溶液各20 μL進(jìn)行分析，記錄數(shù)據(jù)。含量按下式計算:含量/(%)=脂質(zhì)體中藥物的量/總藥量。

3.7 包封率的測定

用高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物。精密吸取 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，置于塑料小管中，8000 r/min高速離心20 min，取上清液進(jìn)樣測定，即得0.5 mL脂質(zhì)體混懸液中游離藥物(W游)。

精密吸取水化后 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體0.5 mL，置于5 mL EP 管中，加入 0.1 mL triton—10破乳，搖勻，取樣測定，即得0.5 mL脂質(zhì)體混懸液中總藥物量(W總)。包封率 =(W總－W游)/W總×100%，測得HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體的包封率，見表1。

表1 同藥脂比的脂質(zhì)體(n=3)的平均含量及包封率Table 1 The average content and entrapment efficiency of liposomes with different drug to lipid ratio(n=3)

4 結(jié)語

實驗的目的是制備具有良好靶向性且包封率高的含硼脂質(zhì)體，用于BNCT研究。磷脂分子形成脂質(zhì)體時，兩條疏水鏈指向雙分子層內(nèi)部，脂溶性藥物可存在于其中;親水基團(tuán)在膜的內(nèi)外兩個表面上，磷脂雙分子層構(gòu)成一個封閉的小室，小室中水溶液被磷脂雙分子層包圍而獨立，其中可容納水溶性藥物。這里所采用的含硼化合物 BBA，其分子量為178.12，具有良好的脂溶性，在將其制成脂質(zhì)體的過程中，BBA可存在于磷脂雙分子層內(nèi)部，獲得較高的包封率。徐梁[9]等將H103BO3和籠狀物(Et4N)102BH10分別包入脂質(zhì)體，成功制備了胃癌免疫脂質(zhì)體，為胃癌的硼中子俘獲治療提供了有效的治療途徑。脂質(zhì)體作為藥物載體的應(yīng)用雖然具備了許多優(yōu)點，但也存在一定的局限性，對于某些水溶性藥物包封率較低，藥物易從脂質(zhì)體中滲漏，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，均是脂質(zhì)體工業(yè)化生產(chǎn)過程中亟待解決的問題。

許多腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞膜表面都有一種特殊的蛋白質(zhì)過度表達(dá)，這種蛋白質(zhì)可特異地識別、結(jié)合葉酸，被稱為葉酸受體 (folate receptor，F(xiàn)R)。通過受體—配體特異性識別并結(jié)合，葉酸—藥物載體通過內(nèi)吞作用進(jìn)入到這些腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)藥物的靶向性[10]。將BBA制備成葉酸靶向脂質(zhì)體，但仍需進(jìn)一步研究葉酸高表達(dá)的MCF—7細(xì)胞對該靶向脂質(zhì)體的攝取、內(nèi)化及脂質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)的滯留與分布實驗。

實驗成功制備了靶向硼脂質(zhì)體，BBA葉酸靶向脂質(zhì)體的包封率高達(dá)94%，為BNCT治療乳腺癌提供了一種靶向給藥途徑。

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