膠質(zhì)瘤細(xì)胞系攝取BPA的實驗研究

楊 磊，王 瀟，隋 麗，孔福全，郝小娟，鄭潔瑩，馬南茹，崔素珍，劉權(quán)衛(wèi)，趙 葵

(中國原子能科學(xué)研究院，北京 102413)

1 前言

癌癥對人類健康威脅極大，癌癥病人每年新增逾百萬，其中惡性腫瘤的死亡率相當(dāng)高，因此，癌癥的診斷和治療已成為醫(yī)學(xué)上的一大難題。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有化療、放療和外科手術(shù)等，盡管這些治療方法對某些癌癥取得了一些成功，但對部分惡性腫瘤(如腦膠質(zhì)瘤和黑色素瘤等)，上述治療方法尚無能為力。

理想的放射治療方法要求能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，而不破壞正常腦組織的結(jié)構(gòu)和功能。硼中子俘獲治療(boron neutron capture therapy，BNCT)從理論上能滿足上述要求，預(yù)期成為一種理想的膠質(zhì)瘤等惡性難治腫瘤的治療方法。

BNCT兼有中子穿透力和重離子的殺傷力，能夠同時殲滅分裂和不分裂的腫瘤細(xì)胞。有自適應(yīng)定位能力，對腫瘤體周邊組織無明顯的輻射損傷。BNCT幾乎集中所有針對惡性腫瘤放射性治療的優(yōu)點，特別適用于治療腦膠質(zhì)瘤(glioblastoma multiforme，GBM)[1，2]。我國 GBM 年發(fā)病率，據(jù)推測人數(shù)在3萬～6萬/年，多發(fā)于青壯年。BNCT為許多用傳統(tǒng)方法無法治療的腫瘤提供了一種新的治療方法。

目前，由周永茂院士研發(fā)、凱佰特公司投資、中國原子能科學(xué)研究院設(shè)計建造的世界首臺“醫(yī)院中子照射器”已達(dá)臨界投入運行，為開展BNCT研究提供了最重要的平臺?！搬t(yī)院中子照射器”是一種基于微型反應(yīng)堆的、在細(xì)胞尺度治療癌癥的新型核技術(shù)醫(yī)療器械。雖然該裝置已于2009年12月臨界，但是要達(dá)到進(jìn)行BNCT的目標(biāo)仍任重道遠(yuǎn)，其中包括對該裝置中子特性(中子能譜、中子通量分布)的研究、含硼藥物研究、中子輻射微劑量學(xué)研究以及必要的為臨床準(zhǔn)備的醫(yī)學(xué)實踐等。

BNCT方法的成功之處在于有足夠的10B到達(dá)腫瘤細(xì)胞的同時，有很少的含硼藥物到達(dá)健康組織。用適當(dāng)?shù)闹凶觿┝空丈淠繕?biāo)組織，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的劑量應(yīng)足夠大，以使細(xì)胞中毒而又在正常組織的忍受范圍之內(nèi)。因此，準(zhǔn)確地控制細(xì)胞中硼的宏觀濃度在BNCT研究上非常重要。本實驗對膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BPA的攝取和析出進(jìn)行了相關(guān)的研究，為今后將要進(jìn)行的BNCT細(xì)胞輻照實驗提供了劑量計算的重要數(shù)據(jù)和實驗依據(jù)。

2 實驗材料及方法

2.1 實驗材料

C6(大鼠腦膠質(zhì)瘤)細(xì)胞系、U251(人腦膠質(zhì)瘤)細(xì)胞系均購自北京協(xié)和細(xì)胞中心(Cell Resource Center)。新生Wistar大鼠購自北京芳元緣養(yǎng)殖場。BPA由美國俄亥俄州立大學(xué)楊偉廉教授惠贈，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 BPA結(jié)構(gòu)Fig.1 BPA structure

2.2 BPA－果糖溶液的配制

取 BPA 粉末 522.75 mg(2.5 mmol)，果糖450 mg(2.5 mmol)，溶于 80 mL 去離子水中，加入少許NaOH溶液加速溶解。待粉末完全溶解后，加HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 7.4左右。最后用去離子水定容100 mL。最終所得溶液 BPA濃度為2.5×10－5mol/mL，即10B 的濃度為 2.5 × 10－5mol/mL(250 μg/mL)。將溶液通過 0.2 μm 微孔濾膜過濾除菌，以備使用。

2.3 大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞對BPA的攝取實驗

2.3.1 大鼠膠質(zhì)細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

將出生1～2 d的新生Wistar大鼠脫頸處死，用75%的酒精浸泡消毒后，采用無菌方法迅速取出大腦，用Hanks液洗滌并剔除腦膜和血管，取大腦皮質(zhì)，用0.25%胰蛋白酶，37℃消化數(shù)分鐘，用吸管反復(fù)吹打后過濾，離心(1000 r/min，3 min)，吸去上清，加入DMEM(dulbecco modified eagle medium)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。計數(shù)后按2×105mL接種于培養(yǎng)皿，并加入DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液，10 d左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿。

選用2 d的大鼠進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，而且培養(yǎng)皿沒有經(jīng)過多聚賴氨酸預(yù)處理(因為在沒有多聚賴氨酸的情況下，神經(jīng)元細(xì)胞貼壁能力非常弱)，可以最大程度地減少皮質(zhì)神經(jīng)元的污染。

2.3.2 實驗方法

向培養(yǎng)皿中加入不同體積的BPA－果糖溶液，使 BPA 終濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL。培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心(1500 r/min，5 min)，棄上清，向待測樣品中加入0.3 mL的70%高氯酸、0.6 mL的30%雙氧水和5 μL的磷酸，然后用磁力恒溫攪拌器升溫到90℃左右，進(jìn)行水浴加熱2 h。加入生理鹽水稀釋定容至5 mL，保證稀釋樣品中的硼濃度大于感應(yīng)耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(induced couple plasma－atomic emission spectroscopy，ICP －AES)的檢測下限，用微孔濾膜過濾后，以未經(jīng)含硼培養(yǎng)液孵育的樣本調(diào)節(jié)零點，采用感應(yīng)耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定溶液中硼的濃度，每組樣本進(jìn)行3次平行測量。

2.4 U251細(xì)胞系對BPA的攝取實驗

2.4.1 U251 細(xì)胞的培養(yǎng)

U251細(xì)胞系為人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。細(xì)胞置于MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含15%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，100 Ku/L的青霉素，100 mg/L的鏈霉素。培養(yǎng)條件:37℃，5%CO2/95% 空氣，100%相對濕度下生長。2～3 d傳代一次，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞處于未分化的對數(shù)生長期。

2.4.2 實驗方法

實驗過程及ICP－AES樣本的制備方法同2.3.2 節(jié)。

2.5 C6細(xì)胞系對BPA的攝取及析出實驗

2.5.1 C6 細(xì)胞的培養(yǎng)

C6細(xì)胞系為大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。細(xì)胞在含5%胎牛血清(杭州四季青生物公司)、15%馬血清(奧地利PAA公司)、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的F10培養(yǎng)基中，置于37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度。每2～3 d換液1次，待細(xì)胞增長至70%融合時，消化以1∶3分瓶傳代。

2.5.2 C6細(xì)胞對BPA的攝取實驗

實驗過程及ICP－AES樣本的制備方法同2.3.2 節(jié)。

2.6 室溫下C6細(xì)胞對BPA的析出實驗

將C6細(xì)胞培養(yǎng)在含BPA濃度分別為20、60、100 μg/mL的培養(yǎng)基中，24 h后，小心吸出培養(yǎng)液，以PBS液洗滌3遍，然后加入不含BPA的培養(yǎng)基在25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在換液后的1、2、3 h后，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃環(huán)境中消化1 min。加入常規(guī)培養(yǎng)液中止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，反復(fù)吹打形成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)后，按上述方法制備樣本，采用ICP－AES法測定溶液中硼的濃度，每組樣本進(jìn)行3次平行測量。

2.7 不同溫度下C6細(xì)胞對BPA的析出實驗

將C6細(xì)胞培養(yǎng)在含BPA濃度為60 μg/mL的培養(yǎng)基中，24 h后，小心吸出培養(yǎng)液，以PBS液洗滌3遍，然后加入不含 BPA的培養(yǎng)基，分別在4、25、37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在換液后的1、2、3 h后，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃環(huán)境中消化1 min。加入常規(guī)培養(yǎng)液中止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，反復(fù)吹打形成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)后，按上述方法制備樣本，采用ICP－AES法測定溶液中硼的濃度，每組樣本進(jìn)行3次平行測量。

3 實驗結(jié)果和討論

3.1 結(jié)果

3.1.1 3種細(xì)胞內(nèi)硼含量隨培養(yǎng)基中硼濃度的變化

3種細(xì)胞(C6，U251，大鼠膠質(zhì)細(xì)胞)在含不同硼濃度(0、20、40、80、100 μg/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞內(nèi)硼含量(μg/107cells)變化如圖2所示。每個細(xì)胞內(nèi)10B原子的數(shù)據(jù)見表1。

表13種細(xì)胞每個細(xì)胞內(nèi)硼原子數(shù)隨培養(yǎng)基中硼濃度的變化Table 1 Number changes of boron atom per cell in three kinds of cells with the boron concentration of the culture medium

由圖2可見，隨著培養(yǎng)基中BPA濃度的增加，3種細(xì)胞內(nèi)的10B濃度均呈上升趨勢。與兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，大鼠膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)10B濃度變化較為平緩。并且，在不同培養(yǎng)基BPA濃度的培養(yǎng)條件下，兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的10B濃度顯著高于膠質(zhì)細(xì)胞(P＜0.01)，而兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的硼濃度相互間無顯著差異(P ＞0.05)。在培養(yǎng)基中BPA濃度分別為 20、40、80、100 μg/mL 的條件下，C6 細(xì)胞內(nèi)的10B濃度與膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的10B濃度之比為2.2、1.87、2.1、2.2、2.3;U251 細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的10B 濃度之比為 1.8、1.7、2.2、2.2、2.3。

圖23種細(xì)胞內(nèi)硼含量隨培養(yǎng)基中硼濃度的變化Fig.2 Boron content changes in three kinds of cells with the boron concentration of the culture medium

3.1.2 C6細(xì)胞在室溫下對10B的析出

在室溫(25℃)下，更換培養(yǎng)液后于不同的時間點(1、2、3h)檢測 C6細(xì)胞內(nèi)10B的含量(μg/107cells)，結(jié)果分別見圖3和表2。

圖325℃時C6細(xì)胞內(nèi)10B的析出Fig.3 10B decrease in C6 cells in 25 ℃

由結(jié)果可見，C6細(xì)胞內(nèi)10B濃度隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸減少。3 h后，當(dāng)培養(yǎng)基中的BPA濃度分別為20、60、100 μg/mL 時，每個 C6 細(xì)胞內(nèi)的10B原子個數(shù)(由表中結(jié)果計算可得)為7.1×109、11.3×109、15.5 × 109個/cell。利用指數(shù)衰減模型模擬曲線后，可得 BPA 濃度為 20、60、100 μg/mL 時，C6細(xì)胞的10B析出速率分別為(0.127±0.012)、(0.115 ±0.005)、(0.126 ±0.005)h－1，并無顯著性差異，平均值為0.123 h－1。因此在室溫(25℃)下，換液后C6細(xì)胞內(nèi)10B濃度C(μg/107cells)可表示為:

C = C0× e－0.123t

式中，C0為細(xì)胞內(nèi)初始10B濃度，可由培養(yǎng)基中BPA濃度得到;t為換液后的時間。

表225℃時C6細(xì)胞內(nèi)10B的析出Table 2 10B decrease in C6 cells in 25℃

3.1.3 C6細(xì)胞在不同溫度下對10B的析出

在不同溫度(4、25、37℃)下，更換培養(yǎng)液后不同時間點(1、2、3 h)檢測 C6細(xì)胞內(nèi)10B的含量(μg/107cells)，結(jié)果分別見表3和圖4。

由結(jié)果可見，更換培養(yǎng)液后，C6細(xì)胞內(nèi)10B濃度隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸減少，并且不同溫度下，10B析出速率不同，溫度越高，速率越大。利用指數(shù)衰減模型模擬曲線后，可得溫度為4、25、37℃時，C6細(xì)胞的10B析出速率分別為(0.021±0.002)、(0.115 ±0.005)、(0.328 ± 0.006)h－1。并且在37℃條件下，3 h后，每個C6細(xì)胞內(nèi)10B原子個數(shù)為6.1 ×109個/cell。

表3 不同溫度下C6細(xì)胞內(nèi)10B的析出Table 3 10B decrease in C6 cells in different temperatures

圖4 不同溫度下C6細(xì)胞內(nèi)10B的析出Fig.4 10B decrease in C6 cells in different temperatures

3.2 討論

1936年，Locher首次提出BNCT治療腫瘤的設(shè)想。此后，多國科學(xué)家利用不同的硼化合物和反應(yīng)堆進(jìn)行了一系列的實驗研究。但早期的研究結(jié)果并不理想，其主要原因之一是硼化合物對腫瘤的親和力不夠強，10B不能富集到腫瘤內(nèi)。經(jīng)過不懈的探索，20世紀(jì)80年代后期，日本神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Yutaka及其同事合成了BPA，將其用于動物實驗取得了較理想的效果[3]。

作為BNCT中使用的硼攜帶劑，應(yīng)具備以下特點:選擇性結(jié)合腫瘤細(xì)胞，最好能在瘤細(xì)胞內(nèi)、尤其是細(xì)胞核內(nèi)聚集;不論單獨使用或與其他硼化合物結(jié)合使用，其濃度應(yīng)達(dá)到每個瘤細(xì)胞內(nèi)約109個10B原子，或每克腫瘤組織中10B含量為20～35 μg;腫瘤與正常組織濃度比達(dá)3∶1～4∶1;在照射治療期間能在腫瘤組織中保持一定濃度;腫瘤中聚集的硼化物對人體無毒性[4]。有實驗證明，當(dāng)大鼠血腦屏障未被破壞時，BPA注射2.5 h后的腫瘤與血液濃度比為8.5，腫瘤與腦組織濃度比為5.9;當(dāng)血腦屏障被破壞后，注射2.5 h后，腫瘤與血液BPA濃度比達(dá)10.9，腫瘤與腦組織濃度比可達(dá) 7.5[5]。在實驗中，于含硼培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，C6和U251兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的硼濃度比平均為2.0和2.2，有顯著性差異。雖然與文獻(xiàn)報導(dǎo)的體內(nèi)實驗結(jié)果有些差距(這可能與腫瘤組織內(nèi)某些特殊的微環(huán)境因素有關(guān)，體外實驗不可能完全模擬體內(nèi)的狀況)，但此結(jié)果仍能說明BPA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高選擇性。同時，在不同濃度含硼培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的硼原子數(shù)均達(dá)到109個;在C6細(xì)胞的硼析出實驗中，在析出速率最快(37℃)的條件下，3 h后，每個細(xì)胞內(nèi)的硼原子數(shù)依然有109個，表明在實驗所選擇的BPA濃度跨度(20～100 μg/mL)，溫度跨度(4～37 ℃)和時間跨度(1～3 h)下，BPA達(dá)到了BNCT所要求的每個瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)有109個10B原子的最低要求。

BPA是一種酪氨酸前體類似物，其選擇性作用機制尚不清楚。起初有人認(rèn)為，BPA僅通過自由擴散進(jìn)入瘤細(xì)胞內(nèi)，也有學(xué)者表明了它與另一種含硼藥物BSH相比，主動運輸在細(xì)胞吸收BPA的過程中起到了重要作用[6，7]。有文獻(xiàn)報導(dǎo)[3]，在一定濃度的含硼培養(yǎng)基中，隨著孵育時間的延長，C6、SHG－44和BT－325三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)BPA濃度逐漸增加，至24 h末仍有繼續(xù)增加的趨勢，而大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在孵育前12 h內(nèi)逐漸上升，后12 h內(nèi)濃度趨于穩(wěn)定。這在一定程度上說明了除自由擴散外，尚有主動運輸這一吸收方式的存在。BPA可能參與處于分裂細(xì)胞、尤其是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生命活動。實驗還表明，C6、SHG－44和BT－325三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞G2/M期與G0/G1期相比，硼含量均明顯增高，說明有絲分裂的過程可以加速BPA的吸收，而主動運輸也許就出現(xiàn)在有絲分裂過程中。同時，3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，G2/M期濃度均有顯著提高，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞最終硼濃度趨向穩(wěn)定，表明膠質(zhì)瘤的有絲分裂過程與正常膠質(zhì)細(xì)胞的差異性決定了對BPA的主動運輸作用。G0/G1期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)硼濃度與膠質(zhì)細(xì)胞相比，濃度差異不如G2/M期明顯，可能是因為這一期瘤細(xì)胞對BPA的吸收以自由擴散為主，而這一方式不依賴于細(xì)胞類型。并且，作為酪氨酸類似物，BPA應(yīng)由細(xì)胞的L－氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運輸，在細(xì)胞內(nèi)部不會產(chǎn)生代謝變化[8]。因此，在硼析出實驗中，采用指數(shù)衰減模型模擬硼析出速率是合理的[9]。

實驗采用的兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，C6來源于大鼠，而U251為人源性。兩種瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性相近，對BPA的吸收作用也相近，這說明了BPA對膠質(zhì)瘤作用的廣泛適用性。

本項工作為以后將要進(jìn)行的BNCT實驗提供了建立10B濃度－細(xì)胞存活率數(shù)學(xué)模型，以及輻照過程中的劑量計算所需的基本數(shù)據(jù)。

為了從理論上建立相似的模型，有學(xué)者用蒙特卡羅模擬方法，通過微劑量學(xué)模型來計算高LET射線穿過核時的徑跡，以期得到細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上的吸收劑量及其生物學(xué)效應(yīng)。然而，通過這種方法很難得到一個與實驗結(jié)果相符的正確結(jié)論，因為在計算過程中，細(xì)胞的形態(tài)以及硼化合物在細(xì)胞內(nèi)的分布都是假設(shè)值。在實際過程中，細(xì)胞的形態(tài)以及10B在細(xì)胞內(nèi)的微觀分布可能會隨在照射過程中發(fā)生改變。這些因素對于BNCT的生物學(xué)效應(yīng)的評估造成了很大的不確定性。與理論模型相反，筆者從實驗結(jié)果中提取的數(shù)學(xué)模型，避免了相關(guān)的假設(shè)條件，很大程度上降低了不確定性，因而能更準(zhǔn)確地評價硼中子俘獲反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

在建立此數(shù)學(xué)模型的過程中，由于是離體系統(tǒng)，因此細(xì)胞的外部環(huán)境一定要小心的調(diào)控，并保持恒定，特別是外界環(huán)境的溫度條件，因為由硼析出實驗的結(jié)果可知，溫度對硼的析出速率有著較大的影響。

4 結(jié)語

實驗進(jìn)行了不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對10B的攝取及析出的實驗研究，并建立了在本實驗室條件下利用ICP－AES精確檢測細(xì)胞內(nèi)10B濃度的方法。實驗結(jié)果表明，含硼藥物BPA對不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U251，C6)有廣泛的親和力;并得到了在不同10B濃度和溫度條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞10B的析出速率，表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞的10B析出速率與溫度之間存在依賴關(guān)系，即環(huán)境溫度越高，析出速率越大，并建立了相應(yīng)的計算細(xì)胞內(nèi)10B濃度的數(shù)學(xué)模型。本項工作為以后將要進(jìn)行的BNCT細(xì)胞實驗提供了劑量計算，以及建立10B濃度－細(xì)胞存活率數(shù)學(xué)模型所需的基本數(shù)據(jù)。此模型避免了相關(guān)的假設(shè)條件，降低了系統(tǒng)的不確定性，可更準(zhǔn)確地評價硼中子俘獲反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

但是，由于BNCT過程包含了復(fù)雜的物理和生物學(xué)因素，因此很難對于其生物學(xué)效應(yīng)做出精確的評估?？梢酝ㄟ^增加細(xì)胞內(nèi)10B濃度，以及中子注量的方法來增強BNCT過程對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，但這也同樣增加了對正常組織細(xì)胞的危害。因此，目前優(yōu)化BNCT最有效的方法，仍然是加強含硼化合物對腫瘤的親和力，最大限度地將10B濃聚于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

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