代謝組學(xué)在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物體內(nèi)功能分析中的應(yīng)用

金井好克，何 新

（1.日本；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種參與小分子化合物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，對體內(nèi)物質(zhì)分布起著決定性作用，當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量和功能出現(xiàn)變化或異常時都會引起體內(nèi)物質(zhì)分布的改變。代謝組學(xué)的興起和發(fā)展使生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的認(rèn)知成為可能。代謝組學(xué)能夠解析孤兒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的新功能與疾病的關(guān)聯(lián)性得以闡釋。代謝組學(xué)必將為后基因組研究帶來重大突破。

20世紀(jì)90年代分子克隆研究的重大進(jìn)展推進(jìn)了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子結(jié)構(gòu)的解析。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩大類。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白因具有特征性的ATP Binding cassette而得名，其能夠水解ATP，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物的主動轉(zhuǎn)運(yùn)。除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之外（即不含ATP Binding cassette）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白統(tǒng)稱為SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，截止目前已劃分為51個家族、包括378個成員分子，其中多數(shù)孤兒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能尚未確定，雖然體外研究中發(fā)現(xiàn)某種機(jī)制，但其在生物體內(nèi)的機(jī)制仍不明確。確定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在生物體內(nèi)的功能已成為后基因組時代研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子評價的重要終極目標(biāo)之一，分子克隆解析為達(dá)成此目標(biāo)提供了頗具意義的重要信息。

1 以往轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究中存在的問題

如前所述，目前轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子組成已基本明確，未來的研究方向是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能以何種結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)、以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用。對于前者，結(jié)構(gòu)生物學(xué)可以給出答案，但對于后者，生物體內(nèi)真實(shí)底物的鑒定與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的定量測定技術(shù)是必不可少的。將純化后的cDNA導(dǎo)入至非洲爪蛙卵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)系統(tǒng)中，根據(jù)放射性標(biāo)記的底物攝取情況分析分子克隆后的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能。這種體外分析過程依賴于研究者選擇的理想底物，難以排除人為的隨意性。這種研究模式不能闡明特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的最適底物，也無從確定在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的究竟是不是這個底物。要脫離現(xiàn)今這種“猜謎”式研究模式，必須正確表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在生物體內(nèi)的實(shí)際功能，并采用詳盡的分析方法。代謝組學(xué)能夠全面定量探測化合物的變化，使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的在體研究成為可能。

2 代謝組學(xué)用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的實(shí)例

為了建立生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的代謝組學(xué)研究方法，簡單而言，首先要使特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)發(fā)生大幅度變化，檢測由此造成的代謝組學(xué)變化，再討論轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能與代謝組學(xué)的相關(guān)性?，F(xiàn)代轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能分析中一般采用基因敲除小鼠，將其代謝組與野生型小鼠相比較，結(jié)果清晰易得。也可采用基因過表達(dá)小鼠或大鼠，已有相關(guān)成功案例的報(bào)道。目前代謝組學(xué)正處于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的初級階段，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性可以直接體現(xiàn)出來，比如腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠的尿檢簡單易行，也可檢測轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠或轉(zhuǎn)基因大鼠血液或組織中的成分變化。

代謝組學(xué)用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的另一個決定性理由是代謝組學(xué)定量性良好，特別是對于小鼠尿液等微量樣品也能以高靈敏度的方法進(jìn)行測定。毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）法可用于微量樣品的定量分析，可以預(yù)見這種聯(lián)用技術(shù)將為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究再次帶來重大突破。由于代謝組學(xué)研究綜合全面性的特點(diǎn)，與體外功能分析研究結(jié)果相比可能會獲得一些意想不到的信息。

筆者鑒定SLC 22家族孤兒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能時采用了CE-MS代謝組學(xué)的方法。有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的底物極為多樣，轉(zhuǎn)運(yùn)底物多難猜測，因此多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能不明。SLC 22家族包括多個有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中一部分與已知功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同。筆者以其中之一的OATN1為研究對象，考察其組織分布，發(fā)現(xiàn)OATN1為腎臟獨(dú)有的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在于近曲小管的管腔側(cè)膜中，但基因敲除小鼠的表現(xiàn)型不明顯，未找到特定功能的分析線索。

OATN1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于腎小管管腔側(cè)膜中，與尿液直接接觸，因此其功能的改變應(yīng)該能夠通過尿液成分的變化表現(xiàn)出來，于是筆者以CE-MS法全面分析比較了基因敲除小鼠與野生型小鼠的尿液成分。CE-MS法可分析測定小鼠尿液（每次強(qiáng)制排尿50 μL左右）等微量樣品，以帶電荷的化合物為檢測對象，因此適于分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。以CE-MS法分析測定OATN1基因敲除小鼠的尿液，與野生型小鼠相比，檢出71個有差別的峰。以飛行時間質(zhì)譜儀（TOFMS）測定每個峰的精確分子量，解析出每個峰對應(yīng)的化合物的示性式，再根據(jù)MS/MS解離結(jié)果推測示性式的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中有多個同分異構(gòu)體時，推測生物體內(nèi)可能存在的異構(gòu)體，購買已知化合物作為對照品，確認(rèn)購得化合物的峰與目標(biāo)峰是否能夠重合，如果重合則解析成功。按上述過程進(jìn)行解析，71個峰中的17個峰成功解析。這些化合物中除了OATN1的原本底物之外，也包括OATN1基因敲除小鼠的次生變化產(chǎn)物，需要進(jìn)一步將兩者區(qū)分，因此筆者又進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)OATN1基因細(xì)胞，采用已知的OATN1底物14C標(biāo)記的βhydroxybutyrate，建立OATN1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察17個已解析的化合物能否抑制OATN1介導(dǎo)的14Cβ-hydroxybutyrate的攝取。結(jié)果顯示，17個化合物中有8個化合物強(qiáng)烈抑制OATN1介導(dǎo)的14C β-hydroxybutyrate的攝取，4個化合物的抑制作用較弱，5個化合物完全沒有抑制作用。抑制標(biāo)記物轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物很可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接作用的化合物，不抑制標(biāo)記物轉(zhuǎn)動的化合物可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠次生變化產(chǎn)生的化合物，不屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。按上述方法鎖定了12個底物候選化合物，又考察了OATN1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞對2個放射標(biāo)記物（β-hydroxybutyrate和乳酸）的攝取，發(fā)現(xiàn)OATN1對兩者有顯著攝取作用。如上所述，通過代謝組學(xué)闡明了未知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。其他沒有放射標(biāo)記的10個化合物是底物的潛在候選物。OATN1屬于SLC 22家族，一般來說SLC 22家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物選擇范圍較寬，通過上述研究可推測OATN1在生物體內(nèi)攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)多個底物。

β-hydroxybutyrate是代謝組學(xué)確定的底物之一，屬于酮體，因此明確了OATN1對體內(nèi)酮體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。當(dāng)饑餓或糖尿病發(fā)作時，細(xì)胞不能充分利用葡萄糖，酮體轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，參與三羥酸循環(huán)（TCA）。脂肪酸在肝臟中經(jīng)β-酸化生成酮體，釋放入血液。酮體作為重要能量源，經(jīng)腎小球?yàn)V過進(jìn)入原尿，再經(jīng)腎小管重吸收保留在體內(nèi)，OATN1可能在其中發(fā)揮了重要作用。糖尿病患者酮體濃度大幅升高，造成血液pH下降(糖尿病酮癥酸中毒)，引起全身狀態(tài)惡化，因此可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為分子靶點(diǎn)，通過抑制該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使酮體從尿中排出，防止血液pH值降低。

3 結(jié)語

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白決定著體內(nèi)小分子化合物的分布，抑制其活性可糾正疾病造成的體內(nèi)物質(zhì)失衡，成為治療疾病的分子靶點(diǎn)。實(shí)際上，抗抑郁藥、利尿藥、降血脂藥等已包含了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)腎小管的葡萄糖重吸收，最近葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑作為糖尿病治療藥正處于臨床研究中。中藥中含有多種作用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的化學(xué)成分，代謝組學(xué)完全適用于評價這些成分的藥效。通過研究服用中藥后代謝組學(xué)的變化，從中預(yù)測與之相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分析數(shù)據(jù)建立與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方案。代謝組學(xué)分析是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的有力工具，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白決定著體內(nèi)小分子化合物的分布，代謝組學(xué)技術(shù)全方位定量測定小分子化合物的變化，精確呈現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的物質(zhì)分布。不論是否作用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，服用中藥后代謝組學(xué)變化也為中藥藥效自身的闡釋提供了極為有益的參考，此領(lǐng)域的未來發(fā)展令人期待。