補(bǔ)髓生血顆粒對慢性再障患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及不同血液疾病間差別的影響

羅正凱，王金環(huán)，孫鳳，雍延禮，孫偉正

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

再生障礙性貧血(AA)作為一種造血負(fù)調(diào)控亢進(jìn)“模型”，是一種危害性極大的血液系統(tǒng)疑難病癥。CAA病理機(jī)制主要有造血干細(xì)胞量和質(zhì)異常、免疫異常、造血微環(huán)境損傷等三個學(xué)說。本課題組經(jīng)過近40年的連續(xù)研究，了解和認(rèn)識慢性再障腎虛病機(jī)以及補(bǔ)腎藥物療效機(jī)理和環(huán)節(jié)［1－2］。受體配體結(jié)合時引起的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化可能為其重要機(jī)理之一。鈣離子(Ca2+)通路作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基本上可參與到CAA各個環(huán)節(jié)當(dāng)中。本實(shí)驗(yàn)搜集CAA患者骨髓樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)擬通過對患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測定，以期進(jìn)一步探討補(bǔ)髓生血顆粒對慢性再障的治療機(jī)制。同時觀察不同血液疾病患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平，為血液疾病的診斷和治療提供新的思路。

1 研究對象

本次觀察研究對象共納入CAA患者55例，均來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科2010年1月～2011年3月期間住院或門診治療的CAA患者，隨機(jī)分為治療組和對照組，治療組55例，其中腎陽虛型30例，腎陰虛型25例;對照組53例。治療組予以補(bǔ)髓生血顆粒治療，對照組則予以再造生血片治療。另選取30例健康體檢志愿者作為正常對照組。

2 研究方法

依照文獻(xiàn)［3］所述方法，使用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞。依照Fluo－3－AM(進(jìn)口自美國intrigen公司)試劑盒所述方法對BMMC內(nèi)Ca2+染色，將已分離完畢的BMMC分為A、B兩管，在A管中加入D－PBS，B管中加入 Fluo－3AM熒光素，避光孵育1h。使用美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)Facscalibour流式細(xì)胞儀檢測，利用CELLQuelt功能軟件進(jìn)行參數(shù)的獲取和數(shù)據(jù)分析，激發(fā)光為488nm，波長為526nm，以陰性細(xì)胞為對照，用橫坐前向散射光和縱坐側(cè)向散射光確定細(xì)胞群，開窗定標(biāo)，計(jì)算窗內(nèi)細(xì)胞1萬個在FL1－H的直方圖上，調(diào)整并確定電壓及最大倍數(shù)，在此基礎(chǔ)上計(jì)算被染上的Fluo－3的熒光強(qiáng)度。計(jì)量資料用(s)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。

3 研究結(jié)果

3.1 補(bǔ)髓生血顆粒對CAA患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

CAA患者療前各組骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均高于正常對照組(P＜0.05);經(jīng)過治療，患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較療前均有所下降(P＜0.05)，且治療組下降程度優(yōu)于對照組(P＜0.05)，但療后兩者的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均未達(dá)正常組水平(P＜0.05)。治療前治療組中腎陽虛型CAA患者BMMC內(nèi)Ca2+濃度與腎陰虛型經(jīng)較，無顯著性差異(P＞0.05);經(jīng)治療后，腎陽虛組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度低于腎陰虛組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較見表1。

表1 CAA患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

3.2 不同血液疾病骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度差異比較 見表2。

表2 不同血液疾病骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較

慢性再障組(CAA)、骨髓增生異常綜合征組(MDS)骨髓單個和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度高于正常組(P＜0.05);慢性血小板減少性紫癜組(CITP)、缺鐵性貧血組(IDA)與正常組比較，無顯著性差異。CAA患者明顯低于MDS組(P＜0.05)。CAA組與CITP組比較，無顯著性差異。MDS組均明顯高于IDA組與CITP組(P ＜0.05)。

4 結(jié)論

Ca2+在細(xì)胞的生命活動中具有重要作用，所有類型細(xì)胞的各種功能均不同程度地受Ca2+調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣不僅作為一種重要的第2信使廣泛參與細(xì)胞的運(yùn)動、分泌、代謝和分化等多種細(xì)胞功能活動的調(diào)節(jié)，而且胞內(nèi)鈣離子濃度的變化與調(diào)控對于參與維持存在于細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞器膜兩側(cè)的跨膜梯度差，以及介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用［4］。對于靜息和受刺激時胞內(nèi)鈣離子濃度的準(zhǔn)確了解，是確定鈣離子在刺激反應(yīng)級聯(lián)中作用的重要因素［5］。在大多數(shù)細(xì)胞，胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間增加有兩種可能的來源:一是胞外Ca2+通過Ca2+通道的開啟進(jìn)入胞內(nèi);二是胞內(nèi)鈣庫(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)向胞質(zhì)釋放出Ca2+。細(xì)胞內(nèi)儲存鈣的釋放是通過IP3和RyRs等受體操縱性鈣通道完成的［6］。

鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、參與信號跨膜傳遞以及介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)等重要作用［7］。有學(xué)者研究表明，CAA患者其造血干細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，是通過IFN－r、TNF－α作用靶細(xì)胞后觸動靶細(xì)胞CD95表面蛋白受體，進(jìn)而引起靶細(xì)胞內(nèi)的連鎖生化反應(yīng)，包括Ca2+升高，從而使DNA降解而凋亡［8］。

近年來，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逐漸成為研究的熱點(diǎn)，有學(xué)者認(rèn)為，PLA－IP3通路對于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放與調(diào)節(jié)起著重要作用，是形成細(xì)胞內(nèi)生理變化的重要因素。本研究結(jié)果表明，再生障礙性貧血患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯高于正常組，經(jīng)過藥物干預(yù)，各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平下降。提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高可能是骨髓造血功能異常的標(biāo)志性指標(biāo)之一，這為下一步通過干預(yù)PLA－IP3通路實(shí)現(xiàn)Ca2+水平改變而達(dá)到治療再生障礙性貧血的目的提供了啟發(fā)。

本課題組還使用流式細(xì)胞儀技術(shù)對不同種類血液疾病患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)行了檢測。表明缺鐵性貧血(IDA)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)與正常組無顯著性差異，而骨髓增生異常綜合征(MDS)患者則明顯高于正常組。提示MDS等骨髓增殖類疾病與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的關(guān)系更為密切，而缺鐵性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜患者則與健康組無明顯差異，此類疾病預(yù)后較好。不同種類血液疾病細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的觀察，為今后各類疾病間的鑒別診斷提供了新的思路。

［1］王小東，孫勁暉，梁正賢，等.補(bǔ)髓生血顆粒對慢性再生障礙性貧血患者骨髓AKT磷酸化水平的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):41－43.

［2］施海濤，王金環(huán)，孫岸，等.補(bǔ)腎生血法對慢性再生障礙性貧血患者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK通路的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):49－52.

［3］劉娜.補(bǔ)腎生血法對慢性再生障礙性貧血骨髓造血粘附FAK/P13K通路及 RhoGTP酶的影響［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［4］Loughrey CM，MacEachern KE，Cooper J，et al.Measurement of the dissociation constant of Fluo－3 for Ca2+in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+wave characteristics［J］.Cell Calcium，2003，34(1):1－9.

［5］Liu Y，Zhong Y，Pei J，et al.Inhibitory effect of leptin on growth hormone secretion of GH3 cells:involvement of cell proliferation，apoptosis and intracellular free Ca2+［J］.Cytokine，2009，46(2):245 －250.

［6］Yanagida E，Shoji S，Hirayama Y，et al.Functional expression of Ca2+signaling pathways in mouse embryonic stem cells［J］.Cell Calcium 2004，36(2):135 －146.

［7］Paredes RM，Etzler JC，Watts LT，et al.Chemical calcium indicators［J］.Methods，2008，46(3):143 －151.

［8］王祥麒.CAA患者造血干細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量、CD95+表達(dá)水平及相關(guān)因素的研究［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，4(23):9－10.