磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9在宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中的表達(dá)及相關(guān)性

安風(fēng)仙，王 曉，劉 雯，高彥麗，馬金龍，，徐興欣，陳世明，楊 敏

1山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科，濟(jì)南 250021

2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所，濟(jì)南 250012

3山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心山東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250021

4山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科，濟(jì)南 250012

宮頸癌是威脅女性健康的殺手之一，是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第二位［1］?，F(xiàn)已證實(shí)，人乳頭瘤病毒 (huamn papilloma virus，HPV)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要啟動(dòng)因素，然而越來越多的證據(jù)表明，HPV致癌蛋白僅能導(dǎo)致宮頸細(xì)胞的永生化，僅有HPV的感染也不能導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是集環(huán)境、生物因素和遺傳基因?yàn)橐惑w的，是多種因素共同作用的結(jié)果。這一過程中，HPV的感染及感染后啟動(dòng)的一系列癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常調(diào)節(jié)，最終改變了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。然而目前人們對(duì)于宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變尚不十分清楚，這一瓶頸也制約著宮頸病變的臨床病理診斷工作。絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (extracellular regulated kinase，ERK)是該系統(tǒng)主要的和經(jīng)典的通路，可被多種生長因子、細(xì)胞因子以磷酸化的形式激活，成為磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-extracellular regulated kinase，P-ERK1/2)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。此外，腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，首先要降解細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白激酶 (matrix metalloproteinase，MMP)是由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)產(chǎn)生的蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞局部浸潤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)PV-9000法，檢測了P-ERK1/2和MMP-9在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN)、宮頸鱗癌中的表達(dá)，探討了其在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

材料和方法

標(biāo)本來源 2009年1月至2010年12月由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科收集的石蠟包埋宮頸組織標(biāo)本共133例，其中宮頸鱗58例 (宮頸鱗癌Ⅰ期19例，宮頸鱗癌Ⅱ～Ⅲ期39例)，CIN 45例，慢性宮頸炎30例。所有病例均由病理科確診，所有患者在手術(shù)前均未接受放化療，而且均無其他疾病。

主要試劑 濃縮型鼠抗人P-EK1/2單克隆抗體、MMP-9即用型工作液、PV-9000法免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

P-EK1/2和MMP-9表達(dá)的檢測 取收集的所有石蠟標(biāo)本按4 μm厚連續(xù)切片，按照PV-9000二步法進(jìn)行，常規(guī)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精水化后，微波抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶，滴加鼠抗人P-ERK1/2單克隆抗體 (工作濃度1∶100)、MMP-9即用型工作液，4℃孵育過夜。二抗按照PV-9000試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡下控制DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。陰性對(duì)照使用PBS代替一抗。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽性染色呈棕黃色顆?；驁F(tuán)塊狀，P-ERK1/2陽性定位于細(xì)胞質(zhì)和 (或)細(xì)胞核，MMP-9陽性染色在細(xì)胞漿內(nèi)。選擇具有代表性的兩個(gè)高倍鏡視野，400倍光鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分:基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，≥51%為3分。將每張切片評(píng)價(jià)著色程度分與平均著色細(xì)胞百分率得分各自相乘為其最后得分:≤1分為陰性(－)，2～3分為 (+)，4～6分為 (++)， ＞6分為 (+++)。弱陽性表達(dá)指 (+)，強(qiáng)陽性表達(dá)指≥ (++)［2］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

P-ERK1/2和MMP-9在各組中的表達(dá)情況 在慢性宮頸炎中無著色 (圖1)，在CIN中呈淺黃色-棕黃色 (圖2)，在宮頸鱗癌組織中呈棕黃色-棕褐色(圖3)。P-ERK1/2和MMP-9在慢性宮頸炎、CIN及宮頸鱗癌組織中的陽性率分別為0和0、28.9%和24.4%、及77.6%和65.5%，3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=54.393，P=0.003;χ2=40.968，P=0.005)。

圖1 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在慢性宮頸炎中的表達(dá) (PV-9000，×400)Fig 1 Expressions of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in chronic cervicitis(PV-9000， ×400)

圖2 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá) (PV-9000，×400)Fig 2 Expression of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in cervical intraepithelial neoplasia(PV-9000， ×400)

圖3 P-ERK1/2(A)和MMP-9(B)在宮頸鱗癌中的表達(dá) (PV-9000，×400)Fig 3 Expression of P-ERK1/2(A)and MMP-9(B)in cervical squamous cell carcinoma(PV-9000， ×400)

P-ERK1/2和MMP-9在宮頸鱗癌中表達(dá)的影響因素 在宮頸鱗癌患者中，P-ERK1/2和MMP-9在≤40歲組中的陽性率分別為73.3%和66.7%，與＞40歲組的82.1%(P=2.34)和64.3%(P=1.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在臨床Ⅱ～Ⅲ期組的陽性率分別97.4%和73.4%，明顯高于Ⅰ期的36.8%(P=0.015)和47.4%(P=0.002);在G3組的陽性率分別為86.5%和73.0%，明顯高于G1～G2組的61.9%(P=0.013)和52.4%(P=0.017);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為90.2%和73.2%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的47.1% (P=0.017)和47.1%(P=0.021);腫瘤直徑＞4cm組的陽性率分別為81.4%和76.7%，明顯高于≤4cm組的66.7%(P=0.008)和33.3%(P=0.004)。

宮頸鱗癌組織中P-ERK1/2和MMP-9的相關(guān)性 P-ERK1/2與MMP-9在宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)呈正相關(guān) (χ2=8.955，P=0.006)。

討 論

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，包含8個(gè)亞家族［3］。其中，ERK是其重要的亞家族之一。現(xiàn)已證實(shí)，ERK的活化需首先經(jīng)過磷酸化后轉(zhuǎn)變?yōu)镻-ERK1/2，激活后的ERK隨即轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮主要作用［4］。MAPK-ERK途徑的激活在胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。

宮頸癌的發(fā)病與HPV的感染密切相關(guān)，宮頸上皮感染HPV后，HPV的致癌蛋白E6、E7可以持續(xù)表達(dá)，從而推動(dòng)宮頸病變的發(fā)展?，F(xiàn)已證實(shí)，HPV16 E6蛋白可以介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路，增強(qiáng)正常宮頸上皮的癌變傾向［5］。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了Ras基因突變引發(fā)的宮頸癌細(xì)胞增殖，磷酸化MAPK/ERK1/2隨著宮頸腫瘤向?qū)m頸浸潤癌的進(jìn)展，表達(dá)逐漸增強(qiáng)［6-7］。本研究檢測了P-ERK1/2和MMP-9在慢性宮頸炎、CIN和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示P-ERK1/2在慢性宮頸炎中無表達(dá)，在CIN呈弱陽性表達(dá)，在宮頸鱗癌組織中呈陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P-ERK1/2在宮頸鱗癌的表達(dá)與患者年齡無關(guān)，與腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小有關(guān)，提示P-ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活在慢性宮頸炎—CIN—宮頸癌惡變的演變過程中可能起一定促進(jìn)作用，其激活可能促進(jìn)了宮頸鱗癌的浸潤及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?？傊?，本研究中P-ERK1/2表達(dá)水平與宮頸病變程度有著良好的契合，但因本研究病例數(shù)較少，其能否作為一種診斷宮頸病變的輔助分子標(biāo)志，仍需進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞的發(fā)生轉(zhuǎn)移首先要降解細(xì)胞外基質(zhì)，MMP是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，該酶是鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，其大小各異，底物不盡相同，都有信號(hào)肽、前肽和催化區(qū)等結(jié)構(gòu)域，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分［8］。有研究認(rèn)為，MMP-9的表達(dá)是宮頸癌發(fā)生的早期事件［9］。本研究結(jié)果顯示，從慢性宮頸炎到CIN到宮頸鱗癌組織，MMP-9的陽性率顯著性增高，MMP-9在宮頸鱗癌的表達(dá)與患者年齡無關(guān)，與腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小有關(guān)，提示MMP-9的過表達(dá)可能促進(jìn)宮頸鱗癌的浸潤及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

以往研究證實(shí)，活化的ERK1/2即P-ERK1/2可通過磷酸化抗凋亡分子Bcl-2、激活轉(zhuǎn)錄因子及干擾TRAIL而達(dá)到抗凋亡作用，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，活化的ERK(P-ERK1/2)還可以增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞侵襲［5］。然而，該結(jié)論多依賴于細(xì)胞學(xué)水平的研究，組織學(xué)中研究甚少。本研究結(jié)果顯示，P-ERK1/2、MMP-9在慢性宮頸炎、CIN和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)成正相關(guān)，進(jìn)一步佐證了ERK信號(hào)途徑與MMP-9的表達(dá)調(diào)控關(guān)系。

目前，宮頸癌和CIN的主要診斷方法為宮頸細(xì)胞學(xué)涂片法、陰道鏡檢查和活組織檢查等，其中，細(xì)胞學(xué)檢查是應(yīng)用最廣泛的方法，但其依賴于主觀、形態(tài)學(xué)的方法，有可能存在與組織病理學(xué)診斷差異的問題，而某些客觀的分子標(biāo)志物可以清楚區(qū)分真正的癌變細(xì)胞，從分子生物學(xué)水平客觀評(píng)估細(xì)胞病變級(jí)別，有較高臨床診斷價(jià)值?，F(xiàn)有宮頸病變的診斷分子標(biāo)志物有高危型 HPV相關(guān)標(biāo)志［10］、P16 INK4a［11］和 Ki-67［12-13］等，這些分子標(biāo)志物并不完善，并且單純一種或兩種分子標(biāo)志物的檢查并不能給出準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，所以仍需發(fā)展更多更有參考價(jià)值的分子標(biāo)志物來作為鑒別診斷CIN的病變級(jí)別及CINⅢ和宮頸癌的輔助手段。本研究結(jié)果初步顯示，P-ERK1/2和MMP-9可能作為臨床評(píng)估宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的診斷指標(biāo)，但二者在宮頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用及其機(jī)制、二者之間的相互作用及其機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究和明確。

［1］Canavan TP，Doshi NR.Cervical cancer［J］.Am Fam Physician，2000，61(5):1369-1374.

［2］齊璇，辛?xí)匝?，常吉慶，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2、血管內(nèi)皮生長因子在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義［J］.腫瘤防治研究，2003，30(1):15-17.

［3］Fecher LA，Amaravadi RK.Flaherty KT.The MAPK pathway in melanoma ［J］.Curr Opin Oncol，2008，20(2):183-189.

［4］Arbabi S，Maier RV.Mitogen-activated protein kinase［J］.Crit Care Med，2002，30(1):74-79.

［5］李剛，姚珍薇.ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路在宮頸癌發(fā)病中的作用 ［J］.山東醫(yī)藥，2007，47(24):118-119.

［6］Emilio CA，F(xiàn)ederico C，Jorge RE，et al.Effects of HRAS oncogene on cell cycle progression in a cervical cancer-derived cell line ［J］.Arch Med Res，2005，36(4):311-316.

［7］Chen TP，Chen CM，Chang HW，et al.Increased expression of SKP2 and phospho-MAPK/ERK1/2 and decreased expression of p27 during tumor progression of cervical neoplasms［J］.Gynecol Oncol，2007，104(5):516-523

［8］陳星，任虹平，伊鐵忠，等.VEGF-C MMP9及TIMP-1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2007，34(7):381-384.

［9］Davidson B，Goldberg I，Kopolovic J，et al.Expression of matrix metalloproteinase-9 in squamous cell carcinoma of the uterine cervix-clinicopathologic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization ［J］.Gynecol Oncol，1999，72(6):380-386.

［10］Nicolas FS，Andrea T，Eliane DF，et al.Viralload as a predictor of the risk of cervical intraepithelial neoplasia ［J］.Int J Cancer，2003，103(9):519-524.

［11］Murphy N，Ring M，Heffron CCBB，et al.p16 INK4A，CDC6，and MCM5:predictive biomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer ［J］.J Clin Pathol，2005，58(5):525-534.

［12］Sahebali S，Depuydt CE，Segers K，et al.Ki-67 immunocytochemistry in liquid based cervical cytology:useful as an adjunctive tool［J］.J Clin Pathol，2003，56(9):681-686.

［13］Cheung ANY，Chiu PM，Tsun K，et al.Chromosome in situ hybridisation，Ki-67，and telomerase immunocytochemistry in liquid based cervical cytology［J］.J Clin Pathol，2004，57(7):721-727.