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    新生牛雄性生殖干細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)

    2012-08-08 12:23:30田亞光張貴學(xué)
    關(guān)鍵詞:能性密度梯度精原細(xì)胞

    鄭 鵬,于 磊,田亞光,黃 賀,張貴學(xué)

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150030)

    雄性生殖干細(xì)胞具有自我復(fù)制和分化成精子的能力,是動(dòng)物體內(nèi)唯一能進(jìn)行遺傳信息傳遞的干細(xì)胞。雄性生殖干細(xì)胞既是干細(xì)胞生物學(xué)的重要研究對(duì)象,又是研究精子發(fā)生、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和研究基因功能的重要資源。Brinter等報(bào)道,將可育小鼠的雄性生殖干細(xì)胞移植到不育小鼠的睪丸中并建立精子發(fā)生[1],雄性生殖干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而,雄性生殖干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)卻未獲得成功。直到Kanatsu-Shinohar等和Kubota等先后報(bào)道了小鼠的雄性生殖干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和增殖的成熟體系[2]。生殖干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,將為克隆動(dòng)物[2]、保護(hù)瀕危物種[3]、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[4]、治療雄性不育以及一些人類遺傳疾病的基因治療[5]提供新的機(jī)遇與途徑。最近的研究表明,雄性生殖干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成特定類型的細(xì)胞[6-8],在再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,是繼ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞之后的另一種細(xì)胞來(lái)源。在牛ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞沒(méi)有成功建立之前,進(jìn)行牛雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng),研究牛雄性生殖干細(xì)胞的多能性,闡述細(xì)胞重編程的重要基礎(chǔ)理論具有重要意義。

    目前,關(guān)于哺乳動(dòng)物雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化研究主要集中在小鼠和人,其他動(dòng)物的研究很少。有關(guān)牛雄性生殖干細(xì)胞的研究主要是集中在對(duì)4~6月齡牛雄性生殖干細(xì)胞的分離純化[9-11]、冷凍保存[12]、自體移植[13]、異體移植[14]、體外分化培養(yǎng)[15]等。本文對(duì)新生牛雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行分離純化,對(duì)其培養(yǎng)、鑒定,探討新生牛睪丸雄性生殖干細(xì)胞體外增殖相關(guān)影響因素和技術(shù)體系,以期為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化體系提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與藥品

    新生牛睪丸采自出生后未超過(guò)24 h健康的荷斯坦公牛(哈爾濱市現(xiàn)代生物科技有限公司提供)。無(wú)菌操作取出雙側(cè)睪丸,置于4℃生理鹽水中,2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。

    實(shí)驗(yàn)所用試劑除DMEM/F-12、FBS(購(gòu)自Gibco公司)外,其他無(wú)特殊說(shuō)明外(均購(gòu)自Sigma公司);實(shí)驗(yàn)所用抗體(購(gòu)自Santa cruz公司);RNA提取試劑盒(購(gòu)自Solarbio);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自ABI);Taq酶等(均購(gòu)自大連寶生物公司);雄性生殖干細(xì)胞培養(yǎng)基:DMEM/F-12+2%(或10%)血清+2 mmol·L-1-谷氨酰胺+0.1 mmol·L-1巰基乙醇+1%雙抗+1%MEM非必需氨基酸溶液+1%MEM維生素溶液+10 μg·mL-1胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉+30 μg·mL-1丙酮酸鈉。

    1.2 方法

    1.2.1 生殖干細(xì)胞的分離純化

    參照文獻(xiàn)[16]的方法制備生精細(xì)胞懸液,并采用差速貼壁法和不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分離純化生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞。

    差速貼壁分選采用6種方法:分別是含10%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2~4 h后差速、過(guò)夜培養(yǎng)、進(jìn)行兩步法差速(A);含2%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2~4 h后差速、過(guò)夜培養(yǎng)、進(jìn)行兩步法差速(B);含2%血清的培養(yǎng)液、直接培養(yǎng)過(guò)夜、進(jìn)行一步法差速(C);用明膠包被培養(yǎng)瓶,按照上述三種方法(A、B、C)進(jìn)行差速(A+、B+、C+)。分別在差速前(0 h)、培養(yǎng)2~4 h后差速后、過(guò)夜培養(yǎng)差速后進(jìn)行AKP染色,鑒定生殖干細(xì)胞的比例。

    參照文獻(xiàn)[17-18]的方法進(jìn)行生精細(xì)胞的不連續(xù)密度梯度Percoll分選,Percoll分選法分別采用20%、30%、40%、50%、60%的Percoll液進(jìn)行分選。分選的各層細(xì)胞分別用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行死活染色、AKP進(jìn)行生殖干細(xì)胞的比例鑒定。

    生精細(xì)胞懸液進(jìn)行不連續(xù)密度梯度Percoll分選后,采用A種方法,進(jìn)行兩次差速貼壁分選。分選后用進(jìn)行AKP染色,鑒定生殖干細(xì)胞的比例。

    1.2.2 生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)

    將純化的雄性生殖干細(xì)胞以1×104個(gè)·cm-2的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中(Coing),于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液分別為含2%和10%濃度血清的培養(yǎng)液,檢測(cè)血清濃度對(duì)生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖的影響。在2%血清濃度的培養(yǎng)液中添加100 ng的GDNF培養(yǎng)雄性生殖干細(xì)胞,觀察生殖干細(xì)胞的增殖并進(jìn)行AKP和OCT-4免疫組化染色。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 差速貼壁分選的比較

    差速貼壁分選的結(jié)果見(jiàn)表1,明膠包被培養(yǎng)瓶的方法,并沒(méi)有顯著提高生殖干細(xì)胞的比例(P>0.05);培養(yǎng)2~4 h后差速,10%的血清培養(yǎng)液組的細(xì)胞AKP陽(yáng)性率顯著高于2%的血清培養(yǎng)液組(P<0.05);過(guò)夜培養(yǎng)后,六種方法之間差異不顯著(P>0.05)。

    2.2 不連續(xù)密度梯度分選

    生殖干細(xì)胞懸液梯度分選后,形成兩條帶和最底層的血細(xì)胞。第一條帶的細(xì)胞離心洗滌后,利用臺(tái)盼藍(lán)染色,顯示大部分是死細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞沒(méi)有貼壁。第二條帶的細(xì)胞離心洗滌后,利用臺(tái)盼藍(lán)染色,顯示95%以上都是活細(xì)胞,利用AKP進(jìn)行染色,顯示雄性生殖干細(xì)胞的比例在7%左右(見(jiàn)表2)。

    2.3 差速貼壁分選與不連續(xù)密度梯度分選的比較

    梯度分選后,繼續(xù)進(jìn)行兩次差速貼壁,并與單純的差速貼壁、梯度分選進(jìn)行比較,結(jié)果顯示(見(jiàn)表2),不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細(xì)胞碎屑和血細(xì)胞,但同時(shí)也會(huì)損失一些雄性生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞(回收細(xì)胞數(shù)6.1×106<細(xì)胞總數(shù)107),回收的雄性生殖干細(xì)胞數(shù)與不連續(xù)密度梯度后進(jìn)行差速貼壁分選之間差異不顯著。差速貼壁分選的回收細(xì)胞數(shù)、回收的雄性生殖干細(xì)胞數(shù)顯著高于不連續(xù)密度梯度后進(jìn)行差速貼壁分選,二者的細(xì)胞AKP陽(yáng)性率之間差異不顯著。三種方法的細(xì)胞活率之間差異不顯著??梢?jiàn),不連續(xù)密度梯度分選的作用主要在于除去血細(xì)胞和細(xì)胞碎屑的影響。

    表1 雄性生殖干細(xì)胞差速貼壁分選比較(AKP陽(yáng)性率,%)(n=10)Table 1 Comparison of differential adhesion methods of male germline stem cells(AKP positive rates,%,n=10)

    表2 差速貼壁與梯度分選的比較(n=10)Table 2 Comparison of differential adhesion and gradient sorting method

    2.4 不同培養(yǎng)液的比較

    2.4.1 血清對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響

    將分離純化后的雄性生殖干細(xì)胞懸液以1×104個(gè)·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi),檢測(cè)血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響。雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行緩慢的增殖,并且在培養(yǎng)的0~7 d內(nèi),10%培養(yǎng)液中的增殖速度稍大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度,但差異并不顯著(P>0.05),在培養(yǎng)10 d時(shí),10%培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量小于2%培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量,差異也不顯著(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

    表3 血清對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響(×104)(n=5)Table 3 Impact of serum to male germline stem cells proliferation(×104,n=5)

    2.4.2 血清對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響

    支持細(xì)胞增殖速度較快,并且在培養(yǎng)的7~10d時(shí),10%培養(yǎng)液中增殖速度大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度,且二者之間差異顯著(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

    表4 血清對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響(×104,n=5)Table 4 Impact of serum to sertoli cells proliferation (×104,n=5)

    在2%和10%血清濃度的培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞增殖速度相近,而10%血清濃度的培養(yǎng)液中支持細(xì)胞增殖較快(見(jiàn)圖1),由于競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)空間,不利于雄性生殖干細(xì)胞增殖。因此,本試驗(yàn)在原代培養(yǎng)時(shí),使用2%血清濃度的培養(yǎng)液。

    圖1 血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Impact of different serum concentrations to cell proliferation

    2.5 雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

    將分離純化后的雄性生殖干細(xì)胞懸液以1×104個(gè)·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng),添加100 ng的GDNF能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞增殖(見(jiàn)表5)。增殖的雄性生殖干細(xì)胞集落進(jìn)行AKP、OCT-4染色,集落呈陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖版Ⅰ、Ⅱ(圖版Ⅱ彩版見(jiàn)封二),初步確定雄性生殖干細(xì)胞集落具有一定的多能性。

    表5 GDNF對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響(×104,n=5)Table 5 Impact of GDNF to male germline stem cells proliferation (×104,n=5)

    圖版Ⅰ 培養(yǎng)3 d的雄性生殖干細(xì)胞的AKP染色PlateⅠ AKP staining of male germline stem cells after 3 d cultured,Bar=100 μm

    圖版Ⅱ 雄性生殖干細(xì)胞的OCT-4染色PlateⅡ OCT-4 staining of male germline stem cells

    3 討論與結(jié)論

    3.1 生殖干細(xì)胞的分離與純化

    生精上皮細(xì)胞的分離多采用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶、DNA酶組合法消化,不同的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要采用不同的組合。其關(guān)鍵在于控制消化程度,若消化不足,則管周肌樣細(xì)胞殘余較多;消化過(guò)度,則生精上皮細(xì)胞大量丟失或受損,嚴(yán)重影響細(xì)胞產(chǎn)量及活率。本試驗(yàn)先采用膠原酶處理,獲得較純凈的曲細(xì)精管,然后以胰酶消化曲細(xì)精管獲得生精上皮細(xì)胞。生精細(xì)胞懸液中常常并不能完全徹底地分離出目的細(xì)胞,只能達(dá)到培養(yǎng)物中以某種細(xì)胞為主的程度,所以也常稱為富集(Enrichment)。分離純化的方法主要有:不連續(xù)Percoll密度梯度離心法[17-18]、差速貼壁分選法[19]、流式細(xì)胞分選法[19-20]以及免疫磁珠分離法[6,20]等。本試驗(yàn)應(yīng)用差速貼壁法、不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分選生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞,結(jié)果顯示不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細(xì)胞碎屑和血細(xì)胞,同時(shí)也會(huì)損失一些雄性生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞,綜合考慮,差速貼壁分選法與其他方法相比更加簡(jiǎn)單、可行。

    3.2 生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)與多能性

    目前,精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基種類較多,添加成分各異,一般采用DMEM/F-12為基本培養(yǎng)基。Izadyar等研究認(rèn)為牛精原細(xì)胞在MEM中培養(yǎng)比在KSOM中培養(yǎng)增殖更快[10]。Kubota等比較α-MEM和F12對(duì)小鼠精原細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)的效果,結(jié)果表明α-MEM效果較好,顯示不同動(dòng)物來(lái)源的精原細(xì)胞需要采用不同的培養(yǎng)系統(tǒng)[20]。

    當(dāng)前關(guān)于精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件的相關(guān)報(bào)道中絕大多數(shù)都添加一定量的血清。有研究表明,培養(yǎng)不同動(dòng)物精原干細(xì)胞,培養(yǎng)基中所添加的血清濃度是不同的,對(duì)于牛精原細(xì)胞在無(wú)血清的條件下,培養(yǎng)幾天后精原細(xì)胞大量死亡;加入2.5%血清時(shí),精原細(xì)胞的存活和增殖情況有明顯改善;加入更高濃度血清時(shí),雖然精原細(xì)胞數(shù)目增加,但支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖遠(yuǎn)大于精原細(xì)胞[10]。因此,適宜的血清濃度可以延長(zhǎng)精原細(xì)胞體外存活時(shí)間。膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族的一個(gè)成員。體外試驗(yàn)研究顯示,培養(yǎng)液中添加GDNF影響多種動(dòng)物精原干細(xì)胞的增殖,Shinohara等[19]試圖建立小鼠精原細(xì)胞的無(wú)血清或無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系,但結(jié)果顯示在無(wú)飼養(yǎng)層和GDNF存在時(shí),精原細(xì)胞不能增殖。大多數(shù)關(guān)于精原干細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道均表明,GDNF是調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞增殖、分裂的關(guān)鍵因素之一[15]。在本試驗(yàn)中,采用2%血清,添加GDNF的培養(yǎng)液培養(yǎng)生殖干細(xì)胞,能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞增殖。

    AKP(Alkaline phosphatase)在胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞中的活性很高,干細(xì)胞一旦分化,則AKP呈陰性。AKP常用來(lái)作為鑒定干細(xì)胞特性的標(biāo)志[21]。OCT-4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子,由pou5f1基因編碼,在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,所表達(dá)的蛋白質(zhì)是細(xì)胞全能性的重要標(biāo)志,OCT-4是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,同時(shí)也是體外建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)的關(guān)鍵基因[22]。OCT-4在ESC、PGCs、精原干細(xì)胞中都存在表達(dá)[23],并且用來(lái)鑒定細(xì)胞是處于自我更新、維持未分化的多能性狀態(tài),還是進(jìn)入分化狀態(tài)、失去多能性。因此,試驗(yàn)中應(yīng)用AKP和OCT-4鑒定精原干細(xì)胞,證實(shí)新生牛睪丸中精原干細(xì)胞具有多能性,培養(yǎng)后形成的集落也具有多能性,本研究進(jìn)一步證實(shí)了Simon等關(guān)于精原干細(xì)胞本身就具有多能性,可以直接轉(zhuǎn)化為體細(xì)胞的觀點(diǎn)[8]。

    3.3 雄性生殖干細(xì)胞

    雄性生殖干細(xì)胞作為體內(nèi)位置確定、終身存在,并且能將攜帶的遺傳信息傳遞至下一代的成體干細(xì)胞,在干細(xì)胞研究中的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的:更方便用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究、更方便簡(jiǎn)單地分化成多能干細(xì)胞、為男性不育治療提供新途徑等等。但是,雄性生殖干細(xì)胞的體外增殖和分化一直困擾著生殖干細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)步,雖然在嚙齒類動(dòng)物上完成了生殖干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)鑒定,但是體外生殖干細(xì)胞分化成有活性、有受精能力的可育精子一直沒(méi)有突破,大大限制了雄性生殖干細(xì)胞的應(yīng)用和發(fā)展。

    本試驗(yàn)對(duì)新生牛雄性生殖干細(xì)胞分離純化的方法進(jìn)行研究,并進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定,初步建立了新生牛睪丸雄性生殖干細(xì)胞的分離純化與體外培養(yǎng)技術(shù)體系,將為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化體系提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

    差速壁法能有效分選雄性生殖干細(xì)胞與支持細(xì)胞,2%血清培養(yǎng)液可用于雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng),且培養(yǎng)基中添加GDNF能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞的增殖,增殖形成的雄性生殖干細(xì)胞集落具有多能性。

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