亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備研究

吳亞瓊，高志強(qiáng)，吳延功，張鶴曉，喬彩霞，張利峰，單 虎，尹燕博，朱淑芬，王慧珊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽(yáng) 100026；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266034；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018）

口蹄疫是口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性的偶蹄動(dòng)物共患傳染病，導(dǎo)致幼畜死亡，成年動(dòng)物生產(chǎn)性能下降［1］。根據(jù)Christianson等報(bào)道，該病流行范圍廣，暴發(fā)后很難控制和消滅，至今仍沒有較好的防治方法，使國(guó)際社會(huì)畜牧業(yè)貿(mào)易損失慘重［2-3］。

目前國(guó)內(nèi)進(jìn)出口檢疫經(jīng)常采用常規(guī)RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR來檢測(cè)口蹄疫病毒，其中5′NCR和2B區(qū)域的核酸序列在7個(gè)型間最為保守，為口蹄疫病毒通用性核酸檢測(cè)方法的靶區(qū)域，而1D區(qū)域?yàn)榉中秃怂釞z測(cè)方法的靶區(qū)域［4-5］。本研究參考相關(guān)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方法［6］，針對(duì)目前口蹄疫病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的現(xiàn)狀，以口蹄疫病毒亞洲1型核酸為模板，分別對(duì)以上具有檢測(cè)意義的片段進(jìn)行RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究，并由多家實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用共同定量的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 ROCHE公司的LightCycler 2.0，Roche 480熒光PCR儀，ABI7900HT熒光PCR儀。

1.2 試劑 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6試劑盒，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ，購(gòu)自Promega公司；DNA快速純化回收試劑盒，質(zhì)粒快速提取純化試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司，Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司；其余所有常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 病毒核酸 口蹄疫亞洲Ⅰ型As-1／PK-1／2005病毒核酸，北京出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 熒光定量RT-PCR引物探針 分別根據(jù)5′NCR和1D區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物探針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量研究。引物探針序列見表1。

1.5 口蹄疫病毒As-1／PK-1／2005的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴(kuò)增、克隆和序列分析 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增As-1／PK-1／2005的2個(gè)基因片段。引物序列見表2。

表1 熒光RT-PCR引物探針序列

表2 擴(kuò)增口蹄疫病毒As-1／PK-1／20051nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的引物名稱、序列

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，克隆入TaKaRa公司的pMD20-T載體，挑取出多個(gè)克隆依次進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序，逐步篩選出正確的克隆。

1.6 SP6體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 對(duì)上述重組質(zhì)粒序列進(jìn)行分析，選用Bam HⅠ進(jìn)行完全酶切，可以切出含SP6啟動(dòng)子的先行化DNA片段。用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)物中加入DNase除去其中的DNA模板后，然后用Trizol法重提RNA，將得到的RNA沉淀溶于1.0mL的無(wú)RNA酶的滅菌水中，分裝，20μL／管，凍存于-80℃下，即得到制備好的2種RNA片段。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值 取制備的兩種體外轉(zhuǎn)錄RNA，用DEPC水分別作200倍稀釋，測(cè)定其260 nm和280nm的吸光度值（A260和A280），并通過計(jì)算其比值來衡量物質(zhì)的純度。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN（Version 6）得出單鏈模板的分子量（MW）。按照下面公式計(jì)算初步拷貝數(shù)［7］：拷貝數(shù)＝A260×40×200×微升數(shù)×10-9×6.02×1023次／MW

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)兩個(gè)片段分別應(yīng)用稀釋液（Trizol∶水＝3∶1）稀釋至1×109copies／μL。將制備的兩種RNA進(jìn)行等體積混合，然后進(jìn)行分裝，100μL／管。

1.8 均勻性檢驗(yàn) 隨機(jī)抽取10管標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用表1引物探針在重復(fù)條件下在2次試驗(yàn)中分別測(cè)試這10份RNA樣品，手動(dòng)設(shè)置基線，獲取Ct值。結(jié)果數(shù)據(jù)用單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.9 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 選擇1nt～2208nt片段作為目標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。隨機(jī)抽取制備的標(biāo)準(zhǔn)品，在以下每種條件下放置10支：（1）室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度20%～50%，14d取出進(jìn)行測(cè)試。（2）冰箱冷藏溫度2℃～8℃，6個(gè)月取出進(jìn)行測(cè)試。（3）-20℃，1年后取出進(jìn)行測(cè)試。（4）對(duì)照，-80℃，長(zhǎng)期放置。

對(duì)制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）計(jì)算其拷貝數(shù)，進(jìn)一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。隨機(jī)抽取按上述條件處理后的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用建立的口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型熒光RT-PCR方法來間接測(cè)定重新提取的RNA的拷貝數(shù)。采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.10 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定 采用委托8家外部實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方法來對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值。分別對(duì)制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）計(jì)算其拷貝數(shù)，進(jìn)一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。應(yīng)用建立的口蹄疫病毒通用熒光RT-PCR方法（針對(duì)5′NCR和2B）來間接測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.11 不確定度分析 通過對(duì)實(shí)際檢測(cè)過程進(jìn)行分析，確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度，進(jìn)行評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴(kuò)增、克隆和序列分析 采用表2的引物，成功擴(kuò)增了口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段，并克隆入pMD20-T載體，見圖1。分析序列選取XbaⅠ、Ecor lⅠ對(duì)1nt～2208nt片段和PstⅠ對(duì)3012nt～5155nt片段酶切鑒定正確，見圖2。

對(duì)正確的克隆進(jìn)行測(cè)序，選取序列正確的克隆命名為 pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）。

2.2 SP6體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 用Bam HⅠ酶切上述質(zhì)粒，均能切出含SP6啟動(dòng)子和目的DNA的片段。線性化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得大量的2種RNA片段，純化溶于1.0mL的無(wú)RNA酶的滅菌水中，分裝為20μL／管，共50管，凍存于-80℃中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值 制備的2種RNA進(jìn)行200倍稀釋后，其A260和A280的比值均在1.9±0.1范圍內(nèi)，表明RNA純度較高。初步計(jì)算，1nt～2208nt片段拷貝數(shù)為3.081×1011copies／μL；3012nt～5155nt片段拷貝數(shù)為1.274×1011copies／μL。分別稀釋至1×109拷貝數(shù)／μL進(jìn)行等體積混合分裝，100μL／管，共800管，凍存于-80℃中。

2.4 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 對(duì)隨機(jī)抽取10管標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試后數(shù)據(jù)分析見圖3，圖4和表3。

按F臨界值F0.05（9、10）＝3.14。計(jì)算的F值分別為2.99和1.45，該值＜F臨界值，這表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品中目的核酸片段含量是均勻的。樣品間變異系數(shù)CV%＝，分別為2.17%和2.03%，均小于5%。

2.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果 選擇1nt～2208nt片段作為目標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。將檢測(cè)組與對(duì)照組（-80℃）數(shù)據(jù)分別作兩樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4，表明檢測(cè)組與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 采用委托8家外部實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方法來對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，取平均值作為定值結(jié)果，結(jié)果見表5。

2.7 不確定度分析 標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度包括：分析測(cè)定誤差、RNA提取過程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。根據(jù)我國(guó)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理法規(guī)［8］定值結(jié)果表示方法，可以通過A類評(píng)定方法［9］進(jìn)行評(píng)定。協(xié)作標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)差涵蓋了以上不確定度分量。因此可作為本批標(biāo)準(zhǔn)品2個(gè)基因片段的不確定度（見表5）。

3 結(jié)語(yǔ)與討論

目前市場(chǎng)上有許多口蹄疫病毒核酸檢測(cè)試劑，但缺乏評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。根據(jù)文獻(xiàn)，5′NCR、2B和1D區(qū)域?yàn)槟壳俺Ｓ每谔阋卟《竞怂釞z測(cè)方法的檢測(cè)區(qū)域。因此，選用可以完全包含以上區(qū)域的1nt～2208nt和3012nt～5155nt2個(gè)片段來制備RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。RNA極易降解，我們選擇商品化的RNA提取裂解液Trizol作為基質(zhì)分散RNA，結(jié)果表明其均勻性及穩(wěn)定性效果均很好。

多項(xiàng)結(jié)果分析表明，本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以在實(shí)際生產(chǎn)中作為參比品應(yīng)用于目前檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增2個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)用來規(guī)范用于檢測(cè)的試劑和實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量，消除不同人員操作間的差異，為量值傳遞提供參比品，具有實(shí)用性和適用性。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表5 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

人醫(yī)的某些疾病中已應(yīng)用我國(guó)自己的核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使我國(guó)定量檢測(cè)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果沒有可比性的現(xiàn)狀有了很大改進(jìn)。而動(dòng)物疾病標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究還趨于空白，造成檢測(cè)結(jié)果存在10～100倍的差異。因此，制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化已經(jīng)是目前檢測(cè)動(dòng)物疾病規(guī)范化的一個(gè)重要趨勢(shì)。

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