泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)小鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖與尿酸吸收的影響Δ

吳新榮，臧路平，劉志剛，孫維峰（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州 510010）

高尿酸血癥（Hyperuricemia）是指血液中的尿酸濃度高于正常水平的一種機(jī)體狀態(tài)，其進(jìn)一步發(fā)展會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)。痛風(fēng)是一種關(guān)節(jié)炎癥，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)處或者關(guān)節(jié)周圍形成尿酸單鈉結(jié)晶，促使急性炎癥的發(fā)作和長(zhǎng)期的組織損傷。痛風(fēng)的長(zhǎng)期治療途徑為降低血清和組織中的尿酸濃度。

腎小管上皮細(xì)胞（Renal tubular epithelial cells，RTECs）上固定的各種轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)腎臟物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中尿酸在腎臟中的重吸收作用主要依賴于近端小管上皮細(xì)胞膜上表達(dá)的尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（URAT1）[1]。

泄?jié)岢苑绞嵌嗄陙?lái)臨床治療高尿酸血癥的經(jīng)驗(yàn)方，臨床試驗(yàn)表明，該處方對(duì)高尿酸血癥有良好的治療作用[2]。為進(jìn)一步明確該處方中的主要活性成分，本課題組對(duì)其有效部位進(jìn)行了分離[3]?？傸S酮是在泄?jié)岢苑街刑崛〕龅挠行Р课恢?，已有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物對(duì)尿酸吸收的影響[4]。本文在此研究基礎(chǔ)上，探討泄?jié)岢苑娇傸S酮體外刺激小鼠RTECs對(duì)其尿酸吸收功能的影響，為該藥降尿酸機(jī)制的研究和新藥的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；CKX41熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；68酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

泄?jié)岢苑筋w粒（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，批號(hào)：101118）；DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hanks、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；人轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、percoll細(xì)胞分離液、尿酸、尿酸檢測(cè)試劑盒、MTT（美國(guó)Sigma公司）；I型膠原酶（美國(guó)Gibco公司）；青霉素（0.48 g∶80萬(wàn)u）、鏈霉素（0.96 g∶160萬(wàn)u））購(gòu)自湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司；鼠抗人細(xì)胞角蛋白18抗體、羊抗鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲亞砜（DMSO，廣州化學(xué)試劑廠）；苯溴馬?。ǖ聡?guó)赫曼大藥廠）。

1.3 動(dòng)物

3～5周SPF級(jí)昆明種小鼠，♂，體重（18±2）g，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物使用合格證號(hào)：粵檢證字第2006B020號(hào)）。

2 方法

2.1 泄?jié)岢苑娇傸S酮的制備

泄?jié)岢苑筋w粒粉碎后，60%乙醇回流提取3次，總黃酮粗提液經(jīng)聚酰胺顆粒靜態(tài)吸附2 h達(dá)到平衡后，先以水洗脫，繼以乙醇洗脫，得到的總黃酮含量達(dá)71.84%。

2.2 小鼠RTECs的原代培養(yǎng)與鑒定

用優(yōu)化好的方法對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)：處死小鼠后立即無(wú)菌取腎，去除包膜及脂肪組織，取皮質(zhì)部分，剪碎，消化，過篩，于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰蛋白酶處理細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。制備細(xì)胞爬片，用細(xì)胞角蛋白18多克隆抗體（1∶250）為一抗[5]，羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行SP法染色鑒定。

2.3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs增殖活性的影響

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h使其貼壁后棄上清液，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1）DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT（5 g·L－1）20 μL，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，加入DMSO（100 μL）震蕩后于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），結(jié)果以5個(gè)復(fù)孔的均值表示，參考MTT法公式計(jì)算增殖率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的濃度范圍，進(jìn)行下一步尿酸吸收試驗(yàn)。

2.4 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs尿酸吸收的影響

將細(xì)胞接種到96孔板，在室溫下進(jìn)行尿酸吸收30 min。尿酸吸收試驗(yàn)培養(yǎng)基成分為[6]：NaCl 137 mmol·L－1、KCl 5 mmol·L－1、K2HPO40.1 mmol·L－1、MgSO41.8 mmol·L－1、葡萄糖20 mmol·L－1、HEPEs 10 mmol·L－1（pH 7.4）。設(shè)定尿酸吸收取樣時(shí)間點(diǎn)分別為0、15、30、45、60、75、90 min。吸收結(jié)束后，使用尿酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中剩余尿酸濃度，顯色后，490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。差量法計(jì)算尿酸吸收值，確定試驗(yàn)取樣時(shí)間點(diǎn)。

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h使其貼壁后棄上清，根據(jù)MTT試驗(yàn)確定的尿酸吸收試驗(yàn)濃度，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1）DMEM培養(yǎng)基，以苯溴馬隆為陽(yáng)性對(duì)照。藥物細(xì)胞孵育培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)基吸出，加入尿酸吸收培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，各測(cè)量孔吸取50 μL樣液，根據(jù)尿酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定剩余尿酸濃度，差量法計(jì)算尿酸吸收值，并計(jì)算藥物作用于尿酸吸收的抑制率，結(jié)果以5個(gè)復(fù)孔抑制率的均值表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間差異的比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 小鼠RTECs的原代培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)約3 d后在腎小管節(jié)段邊緣有多邊形細(xì)胞呈島嶼狀長(zhǎng)出，并逐漸增多向四周呈放射樣生長(zhǎng)，至第10天，基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞具有鋪路石樣形態(tài)特征，細(xì)胞較大，排列緊密。細(xì)胞免疫組化染色反應(yīng)顯示抗細(xì)胞角蛋白18染色陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)見大量棕黃色顆粒，襯染的核呈藍(lán)色，純度在90%以上。小鼠RTECs原代培養(yǎng)10 d的情況見圖1；細(xì)胞免疫組化圖片見圖2。

圖1 小鼠RTECs原代培養(yǎng)10 d的情況Fig 1 The day 10 of mouse renal proximal tubule epithelial cell primary culture

圖2 細(xì)胞免疫組化圖片F(xiàn)ig 2 Cell immunohistochemistry picture

3.2 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs增殖活性的影響

高濃度泄?jié)岢苑娇傸S酮（10～5 g·L－1）能顯著抑制細(xì)胞活性，影響細(xì)胞增殖（P＜0.01）；低濃度泄?jié)岢苑娇傸S酮（2.5～0.5 g·L－1）對(duì)細(xì)胞的增殖活性幾乎不產(chǎn)生影響。因此，確定2.5～0.5 g·L－1作為尿酸吸收試驗(yàn)的參考濃度范圍。泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs增殖活性的影響見表1。

表1 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

表1 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

與0 g·L－1比較：＊P＜0.01vs.0 g·L－1：＊P＜0.01

濃度/g·L－1 0 0.5 2.5 5.0 7.5 10.0增殖率/%0.421±0.006 0.423±0.005 0.420±0.001 0.100±0.011＊0.010±0.001＊0.013±0.003＊

3.3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs尿酸吸收的影響

通過前期試驗(yàn)確定，尿酸吸收試驗(yàn)的取樣時(shí)間點(diǎn)為30 min，即細(xì)胞進(jìn)行尿酸吸收30 min后，終止吸收試驗(yàn)，取樣測(cè)量培養(yǎng)基中剩余尿酸濃度。因?yàn)樵谠摃r(shí)間點(diǎn)，尿酸吸收速率達(dá)到最大且未達(dá)到飽和。與未加藥物刺激的RTECs細(xì)胞比較，在藥物刺激細(xì)胞48 h后，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1各濃度對(duì)尿酸吸收均有不同程度的抑制作用，其中較高濃度抑制作用較為強(qiáng)烈。泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs尿酸吸收的影響見圖3。

4 討論

尿酸排泄減少是造成高尿酸血癥的一個(gè)主要原因，尿酸的排泄量取決于腎小管的分泌作用以及分泌后的重吸收作用。固定在腎臟近端小管上皮細(xì)胞管腔側(cè)和基底外側(cè)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)尿酸的分泌和重吸收。

本課題組的前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，泄?jié)岢苑綄?duì)治療高尿酸血癥有一定的療效，為了確定其發(fā)揮作用的活性成分，繼而對(duì)該藥方進(jìn)行分離提取，總黃酮是所分離出的有效部位之一。本研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮在沒有對(duì)小鼠RTECs的增殖活性產(chǎn)生影響的前提下，能夠明顯抑制該細(xì)胞的尿酸吸收功能。提示總黃酮抑制RTECs的重吸收功能可能是泄?jié)岢苑街委煾吣蛩嵫Y的原因之一，而固定在該細(xì)胞上的URAT1是負(fù)責(zé)尿酸重吸收的主要蛋白，這為高尿酸血癥的治療和機(jī)制研究提供了新的理論依據(jù)。

圖3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對(duì)RTECs尿酸吸收的影響Fig1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuochubi decoction on the uric uptake of RTECs

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