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    黏細(xì)菌93431次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化及活性測(cè)定

    2012-08-05 06:03:52王鴻鵬張利平郭立格
    山東醫(yī)藥 2012年14期
    關(guān)鍵詞:抑制率液相組分

    劉 斌,王鴻鵬,陳 川,張利平,石 楠,湯 輝,郭立格

    (河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071002)

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,全球每年新診斷乳腺癌≥120萬(wàn)例[1~3]。乳腺癌給患者帶來(lái)了巨大的痛苦。尋找治療乳腺癌的特效藥物一直是新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。黏細(xì)菌是一類單細(xì)胞[4]、長(zhǎng)桿狀[5]、可滑行運(yùn)動(dòng)[6]的革蘭陰性菌,在系統(tǒng)分類上屬于紫細(xì)菌類群的δ分支,共12個(gè)屬約40個(gè)種[7]。黏細(xì)菌以二等分分裂繁殖,大多生長(zhǎng)在土壤中或食草動(dòng)物的糞便上,有的能分解纖維素[8]。黏細(xì)菌具有產(chǎn)生活性物質(zhì)種類多、結(jié)構(gòu)新且菌株差異大的特點(diǎn)[2,3]。黏細(xì)菌能產(chǎn)生種類眾多的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中相當(dāng)一部分代謝物具有抗真菌、抗細(xì)菌以及抗腫瘤等生物活性[9],而且作用機(jī)制多種多樣,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約100種黏細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)和600種結(jié)構(gòu)類似物[10],為新結(jié)構(gòu)或新作用機(jī)制生物活性物質(zhì)的篩選提供了一類良好的微生物資源。黏細(xì)菌已經(jīng)成為繼放線菌、芽孢桿菌之后的第三大次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌。為了尋找新的抗腫瘤活性成分,2011年8月3日~11月20日,我們對(duì)黏細(xì)菌93431的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化,從中分離到4種組分,利用MTT法對(duì)這4種組分的活性進(jìn)行了檢測(cè)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 黏細(xì)菌93431菌株由河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

    1.1.2 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC,由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng)。

    1.1.3 試劑及器材 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法參見文獻(xiàn)[11];D312大孔吸附樹脂(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司);RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);分析型高效液相色譜儀(日立L-2000,DAD 檢測(cè)器,Thermo ODS-2,5 μm,250 mm ×4.6 mm);制備型高效液相色譜儀(美國(guó)SSI Prep Pump,Model 2001,GRACE Allsphere ODS-2,5 μm,250 mm×4.6 mm);自動(dòng)離心濃縮儀(英國(guó) miVac QUC-23050-100);顯微鏡(OLYMPUSBH-2 JAPAN);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(德國(guó)BMG FLUOstar OPTIMA);冷凍干燥儀(SIM MCFD5508型)。

    1.2 方法

    1.2.1 黏細(xì)菌93431菌株發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的粗提 將93431菌種接種于CAS液體種子培養(yǎng)基,置于搖床中,28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。再將種子液以10%接種量接種到VY/2液體發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量300 mL),搖床中28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液4 800 r/min離心10 min,除去上清液,收集得到菌體及樹脂,向其加入15倍體積的甲醇,置于搖床上振蕩,過(guò)夜浸提,浸提液用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得到發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物。

    1.2.2 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物的分離純化

    將得到的發(fā)酵產(chǎn)物用分析型高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫(流動(dòng)相組分及其比例見表1),初步了解發(fā)酵產(chǎn)物的組成成分。針對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中含量較高的組分,設(shè)計(jì)洗脫方法,利用制備型高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離制備。將收集得到的不同組分置于自動(dòng)離心濃縮儀中,37℃真空離心濃縮,除去甲醇。-80℃低溫冰箱中過(guò)夜后,置冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥,除去水分后得到干品。

    表1 高效液相色譜梯度洗脫流動(dòng)相組分及其比例

    1.2.3 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物活性測(cè)定及毒性檢測(cè) 93431菌株代謝產(chǎn)物的活性測(cè)定采用MTT法[12]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成1×104/mL,每孔180 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將分離得到的93431菌株代謝產(chǎn)物樣品用完全培養(yǎng)基溶解,0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后再將樣品稀釋成4個(gè)濃度梯度,分別為100、50、25、12.5 μg/mL。樣品組每孔加入 20 μL,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,以不加樣品的孔作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下觀察96孔板中各細(xì)胞形態(tài)的變化。然后每孔加入30μL的 MTT(5 mg/mL)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加 DMSO 150 μL/孔,將96孔板震蕩10 min后,492 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(OD值),按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率=[1-(樣品孔OD值/空白對(duì)照孔 OD值)]×100%。93431菌株代謝產(chǎn)物的毒性檢測(cè)用MRC細(xì)胞模型,培養(yǎng)液改用含10%胎牛血清的DMEM,具體方法同上。

    2 結(jié)果

    2.1 93431菌株的性質(zhì)及發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果 93431菌株為革蘭陰性菌,呈細(xì)長(zhǎng)桿狀,在固體VY/2斜面上培養(yǎng)4~5 d即形成圓球形淺黃色子實(shí)體,無(wú)柄,較黏軟。發(fā)酵液呈淺黃色且清澈透亮。

    2.2 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化結(jié)果分離結(jié)果表明,93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物成分比較復(fù)雜。對(duì)含量較高的組分即保留時(shí)間50~60 min的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離。為了獲得93431菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的單一化合物,利用制備液相對(duì)其進(jìn)行分離制備,流動(dòng)相比例調(diào)整為甲醇∶水=72∶28,經(jīng)過(guò)制備液相分離純化,收集得到4種組分,即93431-1、93431-2、93431-3、93431-4,將這 4 種組分濃縮干燥后得到干品,均呈淺黃色粉末狀,易溶于甲醇。

    2.3 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物4種組分的活性測(cè)定及毒性檢測(cè)結(jié)果 4種組分對(duì)MCF-7的抑制效果見表2。4種組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制效果見表3。由表2和表3可以看出,組分93431-2、93431-3和93431-4在100μg/mL濃度作用24 h時(shí),對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率分別為5.08%、12.47%和7.15%,顯示出較低的細(xì)胞毒活性,但遺憾的是這3種組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用也并不明顯,在同樣條件下,對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率分別為6.02%、19.55%和6.9%。而組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制作用,在100μg/mL、作用24 h時(shí),抑制率達(dá)到51.65%,而在同樣條件下,對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率僅為17.54%。

    另外,在加入93431-1(100μg/mL)作用24 h后,MCF-7在形態(tài)上發(fā)生了很大變化,細(xì)胞萎縮呈小球狀,細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少,個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,而空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿,有光澤,貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好。MRC細(xì)胞在加入93431-1后,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)與空白對(duì)照組相比并沒有發(fā)生太大變化。

    表2 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

    表3 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

    3 討論

    對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌,通常用藥物進(jìn)行控制。但常用的化療藥物毒性很大,影響患者的生活質(zhì)量。因此,研究和開發(fā)高效、低毒的抗乳腺癌藥物格外重要。

    本研究對(duì)河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室保藏的黏細(xì)菌93431菌株進(jìn)行活化、培養(yǎng)和發(fā)酵,進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取、收集,并利用分析型高效液相色譜對(duì)活性菌株的發(fā)酵液提取物進(jìn)行了各組分的分離、純化,利用MTT比色法篩選高效、低毒、有抗乳腺癌生物活性的物質(zhì)。為活性組分的制備和結(jié)構(gòu)測(cè)定以及為靶向抗乳腺癌藥物的開發(fā)和利用做準(zhǔn)備。

    利用分析型高效液相色譜對(duì)93431菌株發(fā)酵液中次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化方法進(jìn)行了系統(tǒng)的探索,確定了菌株93431代謝產(chǎn)物的洗脫條件,建立了適合菌株93431發(fā)酵液中活性產(chǎn)物的分析方法,即用 Thermo ODS-2、5 μm、250 mm ×4.6 mm 的色譜柱,選擇甲醇和水為流動(dòng)相,設(shè)定流速為1 mL/min,進(jìn)行80 min梯度洗脫,從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)組分。

    利用制備型高效液相色譜,即用GRACE Allsphere ODS-2、5 μm、250 mm ×10 mm 的色譜柱,選擇甲醇∶水=72∶28為流動(dòng)相,設(shè)定流速為4 mL/min,進(jìn)行70 min等梯度洗脫,從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分析出4個(gè)組分,分別命名為93431-1、93431-2、93431-3、93431-4。

    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),組分93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用,其濃度和其對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率之間存在較好的量效關(guān)系,隨著93431-1濃度的增長(zhǎng),對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率也增大。但因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用樣品的最大濃度為100μg/mL,未能測(cè)得93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最大抑制率。有待對(duì)組分93431-1、93431-2、93431-3和93431-4分別進(jìn)行配伍,并進(jìn)一步提高組分93431-1的濃度,對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用做更完善的研究。

    組分93431-1呈淺黃色粉末狀,有較強(qiáng)的極性,易溶于甲醇。采用MTT法以MCF-7、MRC細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行93431菌株代謝產(chǎn)物的活性及毒性測(cè)定,結(jié)果表明組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制效果明顯,在藥物濃度為100μg/mL作用24 h的條件下,93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率達(dá)到51.65%,且對(duì)MRC細(xì)胞毒性較小。對(duì)93431-1的結(jié)構(gòu)測(cè)定及其抗癌活性的機(jī)理的研究正在進(jìn)行之中。

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