• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黏細(xì)菌93431次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化及活性測(cè)定

    2012-08-05 06:03:52王鴻鵬張利平郭立格
    山東醫(yī)藥 2012年14期
    關(guān)鍵詞:抑制率液相組分

    劉 斌,王鴻鵬,陳 川,張利平,石 楠,湯 輝,郭立格

    (河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071002)

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,全球每年新診斷乳腺癌≥120萬(wàn)例[1~3]。乳腺癌給患者帶來(lái)了巨大的痛苦。尋找治療乳腺癌的特效藥物一直是新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。黏細(xì)菌是一類單細(xì)胞[4]、長(zhǎng)桿狀[5]、可滑行運(yùn)動(dòng)[6]的革蘭陰性菌,在系統(tǒng)分類上屬于紫細(xì)菌類群的δ分支,共12個(gè)屬約40個(gè)種[7]。黏細(xì)菌以二等分分裂繁殖,大多生長(zhǎng)在土壤中或食草動(dòng)物的糞便上,有的能分解纖維素[8]。黏細(xì)菌具有產(chǎn)生活性物質(zhì)種類多、結(jié)構(gòu)新且菌株差異大的特點(diǎn)[2,3]。黏細(xì)菌能產(chǎn)生種類眾多的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中相當(dāng)一部分代謝物具有抗真菌、抗細(xì)菌以及抗腫瘤等生物活性[9],而且作用機(jī)制多種多樣,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約100種黏細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)和600種結(jié)構(gòu)類似物[10],為新結(jié)構(gòu)或新作用機(jī)制生物活性物質(zhì)的篩選提供了一類良好的微生物資源。黏細(xì)菌已經(jīng)成為繼放線菌、芽孢桿菌之后的第三大次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌。為了尋找新的抗腫瘤活性成分,2011年8月3日~11月20日,我們對(duì)黏細(xì)菌93431的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化,從中分離到4種組分,利用MTT法對(duì)這4種組分的活性進(jìn)行了檢測(cè)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 黏細(xì)菌93431菌株由河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

    1.1.2 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC,由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng)。

    1.1.3 試劑及器材 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法參見文獻(xiàn)[11];D312大孔吸附樹脂(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司);RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);分析型高效液相色譜儀(日立L-2000,DAD 檢測(cè)器,Thermo ODS-2,5 μm,250 mm ×4.6 mm);制備型高效液相色譜儀(美國(guó)SSI Prep Pump,Model 2001,GRACE Allsphere ODS-2,5 μm,250 mm×4.6 mm);自動(dòng)離心濃縮儀(英國(guó) miVac QUC-23050-100);顯微鏡(OLYMPUSBH-2 JAPAN);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(德國(guó)BMG FLUOstar OPTIMA);冷凍干燥儀(SIM MCFD5508型)。

    1.2 方法

    1.2.1 黏細(xì)菌93431菌株發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的粗提 將93431菌種接種于CAS液體種子培養(yǎng)基,置于搖床中,28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。再將種子液以10%接種量接種到VY/2液體發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量300 mL),搖床中28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液4 800 r/min離心10 min,除去上清液,收集得到菌體及樹脂,向其加入15倍體積的甲醇,置于搖床上振蕩,過(guò)夜浸提,浸提液用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得到發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物。

    1.2.2 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物的分離純化

    將得到的發(fā)酵產(chǎn)物用分析型高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫(流動(dòng)相組分及其比例見表1),初步了解發(fā)酵產(chǎn)物的組成成分。針對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中含量較高的組分,設(shè)計(jì)洗脫方法,利用制備型高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離制備。將收集得到的不同組分置于自動(dòng)離心濃縮儀中,37℃真空離心濃縮,除去甲醇。-80℃低溫冰箱中過(guò)夜后,置冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥,除去水分后得到干品。

    表1 高效液相色譜梯度洗脫流動(dòng)相組分及其比例

    1.2.3 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物活性測(cè)定及毒性檢測(cè) 93431菌株代謝產(chǎn)物的活性測(cè)定采用MTT法[12]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成1×104/mL,每孔180 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將分離得到的93431菌株代謝產(chǎn)物樣品用完全培養(yǎng)基溶解,0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后再將樣品稀釋成4個(gè)濃度梯度,分別為100、50、25、12.5 μg/mL。樣品組每孔加入 20 μL,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,以不加樣品的孔作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下觀察96孔板中各細(xì)胞形態(tài)的變化。然后每孔加入30μL的 MTT(5 mg/mL)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加 DMSO 150 μL/孔,將96孔板震蕩10 min后,492 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(OD值),按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率=[1-(樣品孔OD值/空白對(duì)照孔 OD值)]×100%。93431菌株代謝產(chǎn)物的毒性檢測(cè)用MRC細(xì)胞模型,培養(yǎng)液改用含10%胎牛血清的DMEM,具體方法同上。

    2 結(jié)果

    2.1 93431菌株的性質(zhì)及發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果 93431菌株為革蘭陰性菌,呈細(xì)長(zhǎng)桿狀,在固體VY/2斜面上培養(yǎng)4~5 d即形成圓球形淺黃色子實(shí)體,無(wú)柄,較黏軟。發(fā)酵液呈淺黃色且清澈透亮。

    2.2 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化結(jié)果分離結(jié)果表明,93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物成分比較復(fù)雜。對(duì)含量較高的組分即保留時(shí)間50~60 min的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離。為了獲得93431菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的單一化合物,利用制備液相對(duì)其進(jìn)行分離制備,流動(dòng)相比例調(diào)整為甲醇∶水=72∶28,經(jīng)過(guò)制備液相分離純化,收集得到4種組分,即93431-1、93431-2、93431-3、93431-4,將這 4 種組分濃縮干燥后得到干品,均呈淺黃色粉末狀,易溶于甲醇。

    2.3 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物4種組分的活性測(cè)定及毒性檢測(cè)結(jié)果 4種組分對(duì)MCF-7的抑制效果見表2。4種組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制效果見表3。由表2和表3可以看出,組分93431-2、93431-3和93431-4在100μg/mL濃度作用24 h時(shí),對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率分別為5.08%、12.47%和7.15%,顯示出較低的細(xì)胞毒活性,但遺憾的是這3種組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用也并不明顯,在同樣條件下,對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率分別為6.02%、19.55%和6.9%。而組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制作用,在100μg/mL、作用24 h時(shí),抑制率達(dá)到51.65%,而在同樣條件下,對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率僅為17.54%。

    另外,在加入93431-1(100μg/mL)作用24 h后,MCF-7在形態(tài)上發(fā)生了很大變化,細(xì)胞萎縮呈小球狀,細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少,個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,而空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿,有光澤,貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好。MRC細(xì)胞在加入93431-1后,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)與空白對(duì)照組相比并沒有發(fā)生太大變化。

    表2 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

    表3 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

    3 討論

    對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌,通常用藥物進(jìn)行控制。但常用的化療藥物毒性很大,影響患者的生活質(zhì)量。因此,研究和開發(fā)高效、低毒的抗乳腺癌藥物格外重要。

    本研究對(duì)河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室保藏的黏細(xì)菌93431菌株進(jìn)行活化、培養(yǎng)和發(fā)酵,進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取、收集,并利用分析型高效液相色譜對(duì)活性菌株的發(fā)酵液提取物進(jìn)行了各組分的分離、純化,利用MTT比色法篩選高效、低毒、有抗乳腺癌生物活性的物質(zhì)。為活性組分的制備和結(jié)構(gòu)測(cè)定以及為靶向抗乳腺癌藥物的開發(fā)和利用做準(zhǔn)備。

    利用分析型高效液相色譜對(duì)93431菌株發(fā)酵液中次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化方法進(jìn)行了系統(tǒng)的探索,確定了菌株93431代謝產(chǎn)物的洗脫條件,建立了適合菌株93431發(fā)酵液中活性產(chǎn)物的分析方法,即用 Thermo ODS-2、5 μm、250 mm ×4.6 mm 的色譜柱,選擇甲醇和水為流動(dòng)相,設(shè)定流速為1 mL/min,進(jìn)行80 min梯度洗脫,從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)組分。

    利用制備型高效液相色譜,即用GRACE Allsphere ODS-2、5 μm、250 mm ×10 mm 的色譜柱,選擇甲醇∶水=72∶28為流動(dòng)相,設(shè)定流速為4 mL/min,進(jìn)行70 min等梯度洗脫,從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分析出4個(gè)組分,分別命名為93431-1、93431-2、93431-3、93431-4。

    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),組分93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用,其濃度和其對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率之間存在較好的量效關(guān)系,隨著93431-1濃度的增長(zhǎng),對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率也增大。但因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用樣品的最大濃度為100μg/mL,未能測(cè)得93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最大抑制率。有待對(duì)組分93431-1、93431-2、93431-3和93431-4分別進(jìn)行配伍,并進(jìn)一步提高組分93431-1的濃度,對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用做更完善的研究。

    組分93431-1呈淺黃色粉末狀,有較強(qiáng)的極性,易溶于甲醇。采用MTT法以MCF-7、MRC細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行93431菌株代謝產(chǎn)物的活性及毒性測(cè)定,結(jié)果表明組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制效果明顯,在藥物濃度為100μg/mL作用24 h的條件下,93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率達(dá)到51.65%,且對(duì)MRC細(xì)胞毒性較小。對(duì)93431-1的結(jié)構(gòu)測(cè)定及其抗癌活性的機(jī)理的研究正在進(jìn)行之中。

    [1]Mettlin C.Global breast cancer mortality statistics[J].CA,1999,49(3):138-144.

    [2]王海英,張利平.黏細(xì)菌:一類重要的微生物資源[J].微生物學(xué)通報(bào),2003,30(2):115-116.

    [3]Gerth K,Muller R.Moderately thermophilic Myxobacteria:novel potential for the production of natural products isolation and characterization[J].Environ Microbiol,2005,7(6):874-880.

    [4]羅立新,汪薇,潘力.黏細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)新型微生物藥物的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(7):10-12.

    [5]Dworkin M.Recent advances in the social and developmental biology of the myxobacteria[J].Microbiol Rev,1996,60(1):70-102.

    [6]王遠(yuǎn)亮,張彩琴.黏細(xì)菌產(chǎn)生多樣性天然活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2006,21(1):69-71.

    [7]郭文杰,朱秋勁,陶文沂,等.產(chǎn)高活性抗癌物質(zhì)卵黃狀多囊菌JSW103(黏細(xì)菌)的篩選[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(2):5-8.

    [8]Shimkets LJ,Woese CR.A phylogenetic analysis of the myxobacteria:basis for their classification[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(20):9459-9463.

    [9]Gaspari F,Paitan Y,Mainini M,et al.Myxobacteria isolated in israel as potential source of new anti-infectives[J].J Appl Microbiol,2005,98(2):429-439.

    [10]Reichenbach H.Myxobacteria,producers of novel bioactive substances[J].JInd Microbiol Biotechnol,2001,27(3):149-156.

    [11]張林松,張利平.黏細(xì)菌BD105產(chǎn)生的抑瘤活性物質(zhì)的分離制備[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(11):5531-5543.

    [12]Wang HP,Zhang L,Shi N.Screening of myxobacteria strains producing bioactive substances against breast cancer[J].Mod Appli Sci,2011,5(1):86-91.

    猜你喜歡
    抑制率液相組分
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    組分分發(fā)管理系統(tǒng)在天然氣計(jì)量的應(yīng)用
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    高效液相色譜法測(cè)定水中阿特拉津
    反相高效液相色譜法測(cè)定食品中的甜蜜素
    一種難溶難熔未知組分板材的定性分析
    黑順片不同組分對(duì)正常小鼠的急性毒性
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:26
    金雀花中黃酮苷類組分鑒定及2種成分測(cè)定
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:09
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    反相高效液相色譜法快速分析紫脲酸
    久久免费观看电影| 国产精品 欧美亚洲| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黄片小视频在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一本久久精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产精品成人在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99国产精品一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品美女久久av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲综合色网址| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久久久国产电影| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲伊人久久精品综合| 国产99久久九九免费精品| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美亚洲日本最大视频资源| 五月开心婷婷网| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产1区2区3区精品| 超碰97精品在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美性长视频在线观看| h视频一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 日本欧美国产在线视频| 国产xxxxx性猛交| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品高清国产在线一区| 欧美性长视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 秋霞在线观看毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 丁香六月天网| 久久狼人影院| 国产精品国产av在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 最近手机中文字幕大全| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日韩av免费高清视频| 五月天丁香电影| 在线观看一区二区三区激情| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 成年人免费黄色播放视频| 制服诱惑二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 男人舔女人的私密视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久这里只有精品19| 久久 成人 亚洲| 中文字幕亚洲精品专区| 国产三级黄色录像| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99久久99久久久精品蜜桃| 韩国精品一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜福利视频精品| av在线老鸭窝| 亚洲国产欧美一区二区综合| 9色porny在线观看| 久久久久久人人人人人| 成在线人永久免费视频| 国产成人欧美在线观看 | 一级片免费观看大全| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 手机成人av网站| h视频一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 十八禁网站网址无遮挡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av国产精品久久久久影院| 中文字幕制服av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产精品久久久人人做人人爽| 精品福利永久在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线 av 中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| a级毛片在线看网站| 久久久国产欧美日韩av| 一区二区三区四区激情视频| 后天国语完整版免费观看| 国产精品免费视频内射| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲免费av在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜福利,免费看| 国产在线一区二区三区精| a 毛片基地| 婷婷色综合大香蕉| 日韩电影二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费看av在线观看网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品免费视频内射| 丝袜脚勾引网站| 在线 av 中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 精品国产国语对白av| 欧美乱码精品一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 91精品国产国语对白视频| 黄色怎么调成土黄色| 中国国产av一级| 人人澡人人妻人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产99久久九九免费精品| 青春草亚洲视频在线观看| 男女国产视频网站| 久久ye,这里只有精品| 在线观看国产h片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 自线自在国产av| 高清欧美精品videossex| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产av精品麻豆| 嫁个100分男人电影在线观看 | 国产一区亚洲一区在线观看| 日本午夜av视频| 99香蕉大伊视频| 婷婷色综合大香蕉| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜福利免费观看在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产精品999| 男女床上黄色一级片免费看| kizo精华| 欧美黑人欧美精品刺激| av视频免费观看在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 波多野结衣av一区二区av| 好男人电影高清在线观看| 另类精品久久| 老司机在亚洲福利影院| av电影中文网址| 在线 av 中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜91福利影院| 丝袜美足系列| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线观看免费高清a一片| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 在线观看免费高清a一片| 一区二区三区四区激情视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 亚洲熟女毛片儿| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品国产av在线观看| 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 看免费av毛片| a 毛片基地| 亚洲图色成人| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品一国产av| svipshipincom国产片| 一本大道久久a久久精品| 国产精品熟女久久久久浪| 咕卡用的链子| 三上悠亚av全集在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 十八禁网站网址无遮挡| 天堂中文最新版在线下载| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 两个人看的免费小视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产又爽黄色视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久性视频一级片| 精品一区在线观看国产| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩欧美一区视频在线观看| 免费高清在线观看日韩| 超色免费av| svipshipincom国产片| 一本久久精品| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看 | 国产一区二区 视频在线| 在线 av 中文字幕| 国产深夜福利视频在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人免费无遮挡视频| 激情视频va一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 女性生殖器流出的白浆| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久影院123| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 亚洲男人天堂网一区| 1024视频免费在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产精品999| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人啪精品午夜网站| 丝袜脚勾引网站| 欧美黑人精品巨大| 久久久亚洲精品成人影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 超碰成人久久| 午夜免费成人在线视频| 成在线人永久免费视频| 日本一区二区免费在线视频| 午夜免费鲁丝| 麻豆乱淫一区二区| 国产主播在线观看一区二区 | 99九九在线精品视频| 国产成人欧美| 亚洲av美国av| 国产色视频综合| 制服人妻中文乱码| 又紧又爽又黄一区二区| 久久狼人影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久这里只有精品19| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 男女高潮啪啪啪动态图| 9热在线视频观看99| 人妻 亚洲 视频| 亚洲黑人精品在线| 精品一区在线观看国产| 99国产精品一区二区三区| 丁香六月天网| 国产成人精品在线电影| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲,一卡二卡三卡| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲国产精品成人久久小说| tube8黄色片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费日韩欧美在线观看| tube8黄色片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一边亲一边摸免费视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲人成77777在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 悠悠久久av| 九草在线视频观看| 亚洲av男天堂| av不卡在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久99一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产欧美日韩一区二区三 | kizo精华| 美女主播在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| kizo精华| 午夜老司机福利片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 丝袜喷水一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99热网站在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲第一av免费看| 久久久亚洲精品成人影院| 美女扒开内裤让男人捅视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 18禁国产床啪视频网站| 只有这里有精品99| 欧美精品av麻豆av| 少妇粗大呻吟视频| 久久久国产精品麻豆| 激情视频va一区二区三区| 18禁观看日本| 视频区欧美日本亚洲| 各种免费的搞黄视频| 亚洲一区中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜免费鲁丝| 欧美日韩黄片免| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片我不卡| 男人添女人高潮全过程视频| 嫁个100分男人电影在线观看 | 宅男免费午夜| 香蕉国产在线看| 一本久久精品| 男女无遮挡免费网站观看| 中国美女看黄片| 黄色毛片三级朝国网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 性色av乱码一区二区三区2| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费看av在线观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产视频一区二区在线看| 亚洲久久久国产精品| 国产成人91sexporn| 五月天丁香电影| 午夜福利,免费看| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美性长视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 99热国产这里只有精品6| 老司机深夜福利视频在线观看 | 老熟女久久久| 男女之事视频高清在线观看 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 99国产精品一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 青草久久国产| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜福利在线免费观看网站| xxx大片免费视频| a 毛片基地| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久av网站| 人人妻人人澡人人看| 老司机亚洲免费影院| 亚洲第一青青草原| 人人妻人人澡人人看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 深夜精品福利| 两人在一起打扑克的视频| 日本欧美国产在线视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲中文av在线| 狂野欧美激情性xxxx| 婷婷成人精品国产| 丝袜美腿诱惑在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产伦人伦偷精品视频| 黄片播放在线免费| 一个人免费看片子| 91国产中文字幕| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 热99久久久久精品小说推荐| 免费在线观看黄色视频的| 99国产精品一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 日本av免费视频播放| 女性被躁到高潮视频| 亚洲久久久国产精品| 国产男人的电影天堂91| 飞空精品影院首页| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产av国产精品国产| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩一级在线毛片| 丁香六月欧美| 精品一品国产午夜福利视频| 国产国语露脸激情在线看| 九色亚洲精品在线播放| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产色视频综合| 国产在视频线精品| 国产成人一区二区在线| 大码成人一级视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 性色av乱码一区二区三区2| 精品少妇久久久久久888优播| 国产日韩欧美在线精品| 美女主播在线视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av有码第一页| 男女高潮啪啪啪动态图| 一个人免费看片子| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲九九香蕉| 青青草视频在线视频观看| av欧美777| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲欧美激情在线| 香蕉丝袜av| 日日爽夜夜爽网站| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线观看免费高清a一片| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久 成人 亚洲| 欧美少妇被猛烈插入视频| bbb黄色大片| 九色亚洲精品在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 中国国产av一级| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美日韩视频精品一区| 下体分泌物呈黄色| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久欧美国产精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产成人av激情在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 又大又爽又粗| 国产精品99久久99久久久不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲色图综合在线观看| a级片在线免费高清观看视频| xxx大片免费视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 91精品国产国语对白视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 中国国产av一级| 美女高潮到喷水免费观看| 一本久久精品| 麻豆av在线久日| 丝袜在线中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 人妻 亚洲 视频| av天堂久久9| 九草在线视频观看| 免费日韩欧美在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av片东京热男人的天堂| 日韩欧美一区视频在线观看| 色视频在线一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 9热在线视频观看99| 国产精品一国产av| 丝袜喷水一区| 久久影院123| 国产免费现黄频在线看| 手机成人av网站| 国产色视频综合| 午夜免费成人在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产男人的电影天堂91| 一二三四社区在线视频社区8| 99久久99久久久精品蜜桃| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩亚洲高清精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲av美国av| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品自拍成人| 久久人人97超碰香蕉20202| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美黑人欧美精品刺激| 婷婷色综合www| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 女性生殖器流出的白浆| 水蜜桃什么品种好| 人人妻人人澡人人看| 成年动漫av网址| 精品少妇久久久久久888优播| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久人人爽人人片av| 国产成人av教育| 国产淫语在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 永久免费av网站大全| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 尾随美女入室| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 大片电影免费在线观看免费| 一二三四社区在线视频社区8| 99国产精品一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 少妇精品久久久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成年美女黄网站色视频大全免费| 免费看av在线观看网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 老司机亚洲免费影院| 波多野结衣一区麻豆| 天天影视国产精品| 免费在线观看日本一区| 大话2 男鬼变身卡| 晚上一个人看的免费电影| 大片电影免费在线观看免费| 国产三级黄色录像| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产国语露脸激情在线看| 精品人妻在线不人妻| 99久久综合免费| 国产黄色免费在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 青春草亚洲视频在线观看| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩av久久| 人人妻人人澡人人看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 丰满少妇做爰视频| 久久九九热精品免费| 搡老岳熟女国产| av国产精品久久久久影院| 久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av电影在线进入| 亚洲精品成人av观看孕妇| 七月丁香在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产av国产精品国产| av网站免费在线观看视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 伦理电影免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 操美女的视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女国产高潮福利片在线看| 人人妻人人澡人人看| 国产一卡二卡三卡精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 狠狠精品人妻久久久久久综合| www.熟女人妻精品国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品免费大片| 成在线人永久免费视频| 另类精品久久| www.精华液| 色网站视频免费| 婷婷色av中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品人人爽人人爽视色| 一级黄片播放器| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品九九99| 久久国产精品影院| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久国产精品影院| 亚洲成国产人片在线观看| www.av在线官网国产| 97精品久久久久久久久久精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 岛国毛片在线播放| 一级黄片播放器| 777米奇影视久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 伊人亚洲综合成人网| 精品人妻1区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av在线app专区| 免费在线观看日本一区|