非小細(xì)胞肺癌組織中Cyclin D1、p16蛋白的表達(dá)變化及意義

張永明，李 輝，楊文鋒，劉 杰，張百江

(山東省腫瘤醫(yī)院，濟(jì)南250117)

細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1是原癌基因，其編碼的蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞周期G1→S檢查點(diǎn)中發(fā)揮正性調(diào)控作用，啟動(dòng)細(xì)胞周期并促進(jìn)DNA合成，加速細(xì)胞增殖。p16基因作為腫瘤抑制基因，在許多人類(lèi)原發(fā)性腫瘤和細(xì)胞株中的突變率為30% ～80%，該基因編碼的蛋白能特異性抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK4)的活性，有效阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。本研究采用免疫組化法對(duì)非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)組織中的Cyclin D1、p16蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，觀察其表達(dá)變化并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2004年1月～2005年5月在山東省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的NSCLC患者96例(均經(jīng)病理檢查確診);男52例，女44例;年齡30～76歲。術(shù)前無(wú)放療、化療及其他抗腫瘤治療史。不吸煙和吸煙指數(shù)≤400年支者36例，吸煙指數(shù)＞400年支者60例。本組腫瘤直徑≤3 cm者27例、＞3 cm者69例;鱗癌28例，腺癌39例，細(xì)支氣管—肺泡癌13例，腺鱗癌11例，大細(xì)胞癌5例。按2009年NCCN制定的NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期23例、Ⅱ期48例、Ⅲ期25例;組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)27例、Ⅱ級(jí)43例、Ⅲ級(jí)26例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。取15例良性肺部疾病患者的肺部正常組織作對(duì)照，其中肺炎性假瘤8例、肺硬化性血管瘤3例、肺結(jié)核4例。

1.2 Cyclin D1、p16蛋白檢測(cè)方法 兩組標(biāo)本用10%甲醛固定，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。采用免疫組化SP法染色［兔抗人單克隆抗體Cyclin D1(即用型)、兔抗人單克隆抗體p16(即用型)、DAB顯色劑及SP試劑盒購(gòu)自福州邁新公司］。用試劑盒提供的陽(yáng)性切片(乳腺癌)作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為Cyclin D1、p16蛋白表達(dá)陽(yáng)性。參考Mattern等［1］介紹的方法，采用陽(yáng)性細(xì)胞半定量分級(jí)法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定:未見(jiàn)細(xì)胞染色為0分、細(xì)胞輕度染色為1分、細(xì)胞中度染色為2分、細(xì)胞深度染色為3分;無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞＜25%為1分、26% ～50%為2分、≥51%為3分;上述兩分值相加，最高分為6分。高倍鏡(×400)下觀察10個(gè)視野并進(jìn)行計(jì)分，取平均分值，得分0、1分為－，2分為+，3、4分為 ++，5、6分為 +++;+～+++判為陽(yáng)性，－判為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在NSCLC組織、肺部正常組織中，Cyclin D1蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者分別為60、1例，p16蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)者分別為63、14例，兩種組織中兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)相比，P均＜0.05。Cyclin D1蛋白的表達(dá)與NSCLC組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，與其余病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P均＞0.05);p16蛋白的表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P均＞0.05)，詳見(jiàn)表1。NSCLC組織中Cyclin D1、p16蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs= －0.298，P ＜0.01)，詳見(jiàn)表 2。

表1 Cyclin D1、p16蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

表2 NSCLC組織中Cyclin D1、p16蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

Cyclin D1蛋白與CDK4或CDK6在細(xì)胞G1期結(jié)合形成復(fù)合物，并作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)編碼蛋白pRb的激酶，使其磷酸化后釋放出與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cyclin D1蛋白過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致G1→S檢測(cè)點(diǎn)缺陷的主要原因。當(dāng)Cyclin D1蛋白表達(dá)失控時(shí)，會(huì)導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［2］。

研究［3］認(rèn)為，Cyclin D1蛋白的過(guò)表達(dá)是NSCLC發(fā)生的一個(gè)早期分子事件。本研究檢測(cè)的NSCLC組織及肺部正常組織中Cyclin D1蛋白的表達(dá)與文獻(xiàn)［4～6］報(bào)道近似。Jin 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1 蛋白在肺鱗癌組織中的表達(dá)高于腺癌，但本研究無(wú)類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。Volm等［8］發(fā)現(xiàn)，在肺鱗癌組織中 Cyclin D1蛋白的表達(dá)與吸煙有關(guān)，而在肺腺癌組織中Cyclin D1蛋白的表達(dá)與患者吸煙無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Cyclin D1的表達(dá)與患者吸煙指數(shù)無(wú)關(guān)，與NSCLC組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，與Betticher等［3］的研究結(jié)果一致。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，NSCLC的轉(zhuǎn)移與Cyclin D1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，而且還與Cyclin D1蛋白表達(dá)的位置密切相關(guān)，即Cyclin D1蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控不單純限于時(shí)間上，還表現(xiàn)為空間調(diào)控。Jin等［7］發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，一部分表達(dá)在核膜下，推測(cè)Cyclin D1蛋白在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)可能是蛋白產(chǎn)生過(guò)多，也可能是核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)的突變所致。本研究發(fā)現(xiàn)，部分NSCLC組織中癌細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，于核邊緣近核膜處濃聚，在肺部良性病變組織中Cyclin D1蛋白位于胞質(zhì)，具體機(jī)制不明。本研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白表達(dá)與NSCLC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5，10］。表明Cyclin D1蛋白在NSCLC中的過(guò)度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，有利于腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。關(guān)于Cyclin D1蛋白過(guò)度表達(dá)與NSCLC分期及預(yù)后的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道一直存在分歧。本研究未發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白的表達(dá)與NSCLC臨床分期有關(guān)。

p16蛋白是多腫瘤抑制基因(MTSI)，通過(guò)抑制CDK4的活性而發(fā)回調(diào)節(jié)作用，而p16蛋白表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)受Cyclin D1的影響，它可與Cyclin D1蛋白競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控CDK4/CDK6的活性，從而阻止、控制細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，p16通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)AUF1而控制Cyclin D1蛋白和 E2F1的表達(dá)［11］。p16基因突變和缺失引起p16蛋白非正常表達(dá)時(shí)，使細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制性生長(zhǎng)［12］。大多數(shù)惡性腫瘤存在p16蛋白表達(dá)下調(diào)。表明p16基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)減弱，其表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙指數(shù)及NSCLC組織學(xué)分類(lèi)、分級(jí)、臨床分期無(wú)關(guān)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道近似［7，14］。Shapiro 等［15］發(fā)現(xiàn)，p16 基因突變與 p16 蛋白不表達(dá)率存在不一致性，p16基因的缺失出現(xiàn)率較p16蛋白表達(dá)缺失的出現(xiàn)率明顯降低，認(rèn)為肺癌組織中p16蛋白表達(dá)缺失與p16基因的缺失關(guān)系不大，而與p16基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系密切，并認(rèn)為p16蛋白的檢測(cè)比p16基因本身的檢測(cè)意義更大。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中p16、Cyclin D1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明只有Cyclin D1和p16蛋白保持正負(fù)調(diào)節(jié)平衡，才能協(xié)調(diào)細(xì)胞的正常分化和增殖，它們的表達(dá)失衡將導(dǎo)致細(xì)胞周期失控而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

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