結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p、SMO的表達(dá)變化及意義

蘇桂源，孫 凱，李國(guó)新，余 江

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515)

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，其作為一類潛在的癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［1～3］。miRNA-338-3p(miR-338-3p)是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其調(diào)控靶目標(biāo)的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。Smoothened(SMO)蛋白是Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵跨膜蛋白，具有開(kāi)關(guān)該信號(hào)通路的作用;Shh信號(hào)通路異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙以及新生血管的形成［4，5］。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p及SMO的表達(dá)情況，為探討兩者可能的內(nèi)在調(diào)控關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年9～12月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者30例，男16例，女14例;年齡(58.8±11.2)歲。其中結(jié)腸癌19例，直腸癌11例?；颊呓邮苁中g(shù)治療時(shí)，留取癌組織，同時(shí)取距離癌腫5 cm的腸黏膜(癌旁組織)及距離癌腫10 cm以上的腸黏膜(作為正常對(duì)照)。全部患者術(shù)前未接受放化療。標(biāo)本采集后用DEPC水處理并快速置液氮中冷凍，－80℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 自miRNA Base數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/)和 Genebank 查找基因序列，用Primer-Express 2.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。miR-338-3p及內(nèi)參照RNU6B由GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)合成。SMO上游引物為5'-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3'，下游引物為 5'-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 322 bp;內(nèi)參照GAPDH上游引物為5'-GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3'，下游引物為 5'-CGTTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)346 bp;上述引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3 miR-338-3p的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)。用Trizol抽提標(biāo)本組織中的總RNA，使用Beckman Coulter DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定 RNA濃度，RNA的 A260nm∶A280nm≥1.8，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳后取 28S、18S泳道的RNA條帶進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)所用RNA具備較高的純度及完整性。使用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Q-PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每個(gè)標(biāo)本均作復(fù)管PCR反應(yīng)。用RNU6B作為內(nèi)參照。樣本中miR-338-3p的ΔCt值 =樣本中 miR-338-3p的 Ct值 －RNU6B的Ct值;因用Real-time Q-PCR來(lái)檢測(cè)RNA時(shí)，不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，故以正常對(duì)照的腸黏膜ΔCt值進(jìn)行校正，得出ΔΔCT值，ΔΔCt=(CtmiR-338-3p－ CtRNU6B)目的樣本－ (CtmiR-338-3p－CtRNU6B)校正樣本，各樣本中 miR-338-3p 的含量用 2-ΔΔCt表示。

1.4 SMO mRNA的檢測(cè) 采用半定量RT-PCR技術(shù)。取提取的總RNA 3μg作為模板合成cDNA，然后進(jìn)行PCR。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用Pharmacia Master Image紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶分析。SMO mRNA相對(duì)含量=目的基因條帶積分吸光度值/內(nèi)參照GAPDH基因條帶積分吸光度值。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.5 SMO蛋白的檢測(cè) 采用Western blot。稱取標(biāo)本組織100 mg，置高壓滅菌的研缽上，加液氮研磨成組織漿，加入蛋白提取液1 mL，充分?jǐn)噭蚝蟪暺扑? min，4℃、12 000 g離心10 min，收集裂解物總蛋白;凱基BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白50μg，加凝膠上樣緩沖液調(diào)整體積，于100℃加熱5 min，使蛋白完全變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并原位電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，該膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉處理后，與兔抗人SMO多克隆抗體和內(nèi)參照β-Acion分別孵育。膜漂洗后分別與辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的特異性二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影得到蛋白印記條帶，以Quantity One軟件檢測(cè)灰度值。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用配對(duì)設(shè)計(jì)兩兩比較t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p的表達(dá)量為0.153 7 ±0.126 4，SMO mRNA 相對(duì)表達(dá)量為 0.371±0.116，SMO 蛋白灰度值為 3.195 ±1.623，癌旁組織分別為 0.901 5 ±0.426 3、0.366 ±0.117、0.733±0.305，兩種組織中的 miR-338-3p、SMO 蛋白表達(dá)相比，P均＜0.01;miR-338-3p與SMO蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= － 0.877，P ＜ 0.01)。SMO mRNA、SMO蛋白的電泳條帶見(jiàn)圖1、2。

圖1 SMO mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)注:T1和N1、T2和N2、T3和N3分別為3例患者癌組織和癌旁組織中的SMO mRNA

圖2 SMO蛋白在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

有學(xué)者［6］曾采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，miR-338-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著下降。提示miR-338-3p基因的表達(dá)缺失可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程。miR-338-3p定位于染色體17q25.3，而染色體17q23-25位點(diǎn)常是多種惡性腫瘤的突變熱點(diǎn)，且其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［7］，此現(xiàn)象亦提示miR-338-3p可能參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，而這亦與我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的miR-338-3p在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中表達(dá)水平更低的結(jié)果相一致。說(shuō)明miR-338-3p可能是一種與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的抑癌基因。

Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由分泌型信號(hào)糖蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白SMO組成的復(fù)合物以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成［8］。其中SMO蛋白是Shh信號(hào)通路中關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，具有調(diào)控Shh信號(hào)通路開(kāi)或關(guān)的作用，即SMO蛋白能夠?qū)⒓?xì)胞外的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli信號(hào)，從而啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)特異基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)Shh信號(hào)通路具有激活作用。研究［9］證實(shí)，Shh信號(hào)通路亦參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和腫瘤血管形成，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，相應(yīng)地激活或抑制Shh信號(hào)亦可促進(jìn)或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。我們通過(guò)TargetScan、PicTar、miRanda等生物信息學(xué)分析軟件篩選miR-338-3p的可能作用靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-338-3p與SMO mRNA 3'非翻譯區(qū)(UTR)存在互補(bǔ)結(jié)合，提示SMO蛋白可能是miR-338-3p在結(jié)直腸癌中新的作用靶點(diǎn)，miR-338-3p可能通過(guò)調(diào)控SMO蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為。

miRNA主要通過(guò)切割降解和翻譯抑制兩種機(jī)制來(lái)調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。由于絕大部分miRNA不能與其靶基因的轉(zhuǎn)錄體完全配對(duì)，故認(rèn)為miRNA主要通過(guò)翻譯抑制的方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［10～12］。本研究證實(shí)，SMO mRNA 在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SMO蛋白卻在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著增高，再結(jié)合miR-338-3p表達(dá)下降且兩者之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系這一結(jié)果，推測(cè)miR-338-3p可能通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)方式與SMO mRNA 3'UTR結(jié)合，故僅能抑制SMO mRNA的進(jìn)一步翻譯，但不能將其根本降解;而結(jié)直腸癌組織中由于miR-338-3p表達(dá)下調(diào)，從而未能于轉(zhuǎn)錄后水平沉默SMO蛋白表達(dá)，導(dǎo)致SMO蛋白表達(dá)上調(diào)，繼而異常激活Shh信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p表達(dá)明顯下調(diào)，SMO蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，miR-338-3p可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制使SMO蛋白表達(dá)下降，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。此為結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制和診斷治療的研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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