葛根異黃酮對衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)長時程增強的影響

王愛梅 徐持華 (河南南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473061)

近年來，國內(nèi)外對葛根提取物——葛根異黃酮的藥理作用進行了較多的研究，發(fā)現(xiàn)其具有治療心血管疾病、抗癌作用，治療骨質(zhì)疏松、預(yù)防和治療糖尿病等作用〔1～4〕。葛根異黃酮對衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)長時程增強(LTP)的影響少見報道，本實驗欲探討葛根異黃酮改善衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及對海馬神經(jīng)突觸可塑性的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康雌性Wistar大鼠55只，3～4月齡，體重(180±20)g，由河南醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供(許可證號:410117)。

1.2 實驗藥物試劑及儀器 D-半乳糖由上海試劑二廠提供，批號20050422，葛根異黃酮由南陽張仲景現(xiàn)代中藥發(fā)展有限責(zé)任公司提供，批號20080722，20%烏拉坦由上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供，批號T20080319，大鼠跳臺系中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，RM6240型生物信號采集系統(tǒng)由成都儀器廠研制。

1.3 動物分組及給藥 Wistar大鼠隨機分為生理鹽水組，衰老模型組，藥物低、中、高劑量組，每組11只。造模時，模型組、藥物組每天頸背部皮下注射1%D-半乳糖100 mg/kg，生理鹽水組每天頸背部皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)6 w。造模成功后，第2天開始灌胃給藥，藥物低、中、高劑量組每天分別給予40、80、160 mg/kg葛根異黃酮灌胃，模型組、生理鹽水組每天給予80 mg/kg生理鹽水灌胃，連續(xù)8 w。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定——Morris水迷宮實驗 動物灌胃結(jié)束后，進行Morris水迷宮實驗。其中定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力，記錄逃避潛伏期(EL);空間探索實驗用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力，記錄120 s內(nèi)大鼠在平臺象限的游泳距離占總距離的百分比。

1.5 電生理學(xué)檢測

1.5.1 大鼠的固定和電極的定位 在行為學(xué)結(jié)束后，大鼠以20%烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔麻醉后，用耳桿將大鼠頭部水平固定于立體定位儀上，參照Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》確定記錄電極和刺激電極的準(zhǔn)確位置，在立體定位儀的引導(dǎo)下緩慢將電極穿過大鼠皮層至海馬，調(diào)整記錄電極及刺激電極在海馬植入的最佳深度，至記錄到最大的群體峰電位(PS)為止。以上操作均在屏蔽籠內(nèi)完成。實驗結(jié)束后，對記錄電極、刺激電極作定位檢查，定位不準(zhǔn)確者剔除。

1.5.2 PS記錄和LTP誘導(dǎo) 海馬CA1區(qū)LTP的誘導(dǎo)方法參照文獻，首先記錄單個刺激誘發(fā)的PS 30 min作為基值，然后給予波寬0.1 ms、頻率100 Hz的矩形波進行高頻刺激(HFS)誘發(fā)LTP，記錄HFS后60 min內(nèi)的 PS。

1.5.3 觀測指標(biāo)和測量方法 實驗中以PS幅度相對值(%)為觀測指標(biāo)，并觀察其增幅情況。具體測量方法是，以HFS前30 min的PS值的均數(shù)為基線值，即100%，實驗中每個PS值與之相比即得各點的PS幅度相對值，PS平均幅值高于基線值至少20%以上并持續(xù)30 min以上者可視為產(chǎn)生了LTP，連續(xù)觀察記錄60 min。PS幅值和潛伏期計算方法參照文獻〔7〕。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 隨著訓(xùn)練的進行，各實驗組EL均不斷縮短，與模型組相比，中、高劑量組EL明顯縮短(P＜0.01);各實驗組撤離平臺后大鼠在原平臺象限內(nèi)游泳的距離占整個游泳距離的百分比顯示:與模型組相比，中、高劑量組所占距離百分比明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)，這說明葛根異黃酮中、高劑量對大鼠空間方位記憶能力有一定的影響。而低劑量組雖然要高些，但差異無顯著性(P＞0.05)，見表1。

2.2 電生理學(xué)檢測結(jié)果 高頻刺激后各組大鼠PS幅度較刺激前增加，表明各組大鼠海馬都有LTP的形成，如表5，高頻刺激后模型組PS幅度有一定程度的增強，但明顯低于生理鹽水組(P＜0.01);中、高劑量組高頻刺激后PS幅度明顯大于模型組(P＜0.01);低劑量組與模型組差異不明顯(P＞0.05)。從高頻刺激后PS幅度變化可看出，生理鹽水組、中、高劑量組在所記錄的60 min內(nèi)變化不明顯，模型組和低劑量組的PS幅度卻隨著時間逐漸衰減。模型組和低劑量組在60 min內(nèi)PS幅度均低于生理鹽水組、中、高劑量組(P＜0.01)。生理鹽水組、中、高劑量組在所記錄的60 min內(nèi)變化不明顯無顯著性差異。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及高頻刺激后PS增幅比較(±s)

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及高頻刺激后PS增幅比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n EL(s) 所占距離百分比(%)PS增幅(%)生理鹽水組 9 20.78±3.122) 44.54±2.292) 170.20±0.562)模型組 9 42.24±5.41 33.94±1.69 124.57±1.06低劑量組 9 25.50±3.661) 38.55±3.70 126.44±0.87中劑量組 10 23.80±1.492) 41.61±2.561) 163.49±0.762)高劑量組 10 21.82±2.742) 43.65±1.562) 166.92±0.742)

3 討論

學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)是神經(jīng)細胞之間的聯(lián)系結(jié)構(gòu)突觸的可塑性變化，大腦邊緣系統(tǒng)海馬結(jié)構(gòu)作為學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，是一個具有可塑性的腦區(qū)。LTP被認為是研究學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)元可塑性的最好的模型〔8〕。LTP一般是指在條件刺激(多為較高頻率的強直刺激)后，相同的測試刺激所引起的誘發(fā)突觸反應(yīng)長時問(一般長于半小時)明顯增大的現(xiàn)象。LTP的形成是突觸前后機制共同作用的結(jié)果，與突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸后相關(guān)受體的Ca2+通道、蛋白激酶、逆行信使、即早基因等關(guān)系密切。在大鼠海馬，來自CA3區(qū)錐體細胞的Schaffer側(cè)支與CA1區(qū)錐體細胞樹突形成突觸，刺激Schaffer側(cè)支使CA1區(qū)錐體細胞任何樹突層受刺激均可誘出LTP。常用群峰電位(PS)振幅增大或PS潛伏期減小來判定突觸傳遞是否強化以及是否出現(xiàn)LTP。LTP反映了突觸可塑性變化中的神經(jīng)電生理活動方面的改變，并作為神經(jīng)科學(xué)研究當(dāng)中衡量突觸可塑性的一個主要的電生理指標(biāo)。本文中，造模后PS振幅減小而用藥后，PS振幅增大說明葛根異黃酮對于突觸的可塑性具有一定的促進作用，并有可能是其改善學(xué)習(xí)記憶功能又一重要機制。

1 郭建平，宮明利，陳啟蒙，等.葛根黃酮滴丸對離體豚鼠心臟冠脈血流量的影響〔J〕.藥物研究，2008;17(5):5-6.

2 徐 芾，金邦荃，武衛(wèi)平，等.植物異黃酮對更年期婦女骨密度和骨代謝血清生化指標(biāo)的影響〔J〕.中國婦幼保健，2007;22:1517-9.

3 王慶端，江金花，孫文欣，等.葛根總黃酮對鼠肝微粒體中細胞色素P450含量的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2000;16(3):354-5.

4 曾 明，張漢明，鄭水慶，等.葛根提取物對糖尿病大鼠血糖和血流動力學(xué)的影響〔J〕.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2004;20(4):293-4.

5 Freir DB，Costello DA，Herron CE.Aβ25-35-induced depression of longterm potentiation in area CAI in vivo and in vitro is attenuated by verapamil〔J〕.J Neurophysiol，2003;89(6):3061-9.

6 Yang Y，Zheng X，Wang Y，et al.Stress enables synaptic depression in CA1 synapses by acute and chronic morphine:possible mechanisms for corticosterone on opiate addiction〔J〕.J Neurosci，2004;24:2412-20.

7 Ikngaya Y，Saim H，Abe K.Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats〔J〕.Brain Res，1994;656:157.

8 Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice〔J〕.Neuroscience，2006;26(4):1077-87.