淫羊藿苷對ConA誘導的小鼠肝臟損傷保護機理的研究①

王恒孝 任 霞 溫培娥 姜國勝 (山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南250062)

肝臟是機體的代謝和解毒器官，近年來研究發(fā)現(xiàn)肝臟中含有大量的免疫細胞，其中T淋巴細胞在病毒性和自身免疫性肝炎的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［1］。刀豆蛋白A(ConA)可引起小鼠肝臟NKT細胞的活化，造成肝臟免疫性損傷［2］。淫羊藿可強腎壯陽扶正固本，具有雄性激素樣作用，淫羊藿苷(Icariin)為淫羊藿的提取物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，其次級產(chǎn)物淫羊藿次苷對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖具有促進和抑制的雙相調(diào)節(jié)作用［3］，另外淫羊藿苷可抑制炎癥和腫瘤的增殖發(fā)生［4］。本實驗利用C57BL/6雄性小鼠建立ConA誘導型肝炎模型，研究觀察淫羊藿苷對該損傷模型保護的免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司，F(xiàn)ITC標記抗小鼠NK1.1、Cy標記的CD3抗體購自BDPharmingen公司，轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒購自上海華盛試劑公司，IFN-γ、TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自R＆D公司 。

淫羊藿苷為課題組從淫羊藿中提取獲得，純度99.6%。淫羊藿苷干粉溶于無水乙醇，待乙醇完全揮發(fā)后用1640不完全培養(yǎng)液溶解，配成10 mg/ml淫羊藿苷注射液。

1.2 動物 C57BL/6雄性小鼠，20～22周齡，體重28～32克，購自北京維通利華實驗動物公司。將實驗小鼠隨機分為淫羊藿苷+ConA組(淫羊藿苷實驗組)、生理鹽水+ConA組(ConA對照組)、淫羊藿苷+生理鹽水組(淫羊藿苷對照組)，每組24只。淫羊藿苷實驗組和淫羊藿苷對照組腹腔注射淫羊藿苷注射液，每次200 mg/kg，每日2次，連續(xù)5天，ConA對照組同期注射等劑量的生理鹽水。淫羊藿苷最后一次注射后12小時，淫羊藿苷實驗組和ConA對照組小鼠行尾靜脈注射ConA，劑量15μg/g，淫羊藿苷對照組注射同劑量生理鹽水。分別于注射ConA 后4、8、16、24、32 小時對小鼠摘眼球放血后脫臼處死，取血清、肝組織，血清-20℃保存，肝組織部分用10%福爾馬林固定保存，部分進行淋巴細胞提取。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清轉(zhuǎn)氨酶水平的測定 取96孔板，每個樣品做ALT/AST各三個平行孔和兩個空白孔，并做五個標準曲線孔(兩組或三組平行)，然后按下列步驟操作:每個樣品孔加5μl血清樣品和25μl谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液/谷草轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液，空白孔只加5μl樣品，充分混勻，37℃水浴30分鐘。每孔加25μl 2，4-二硝基苯肼，充分混勻后空白孔加入25μl ALT基質(zhì)液，混勻后37℃水浴20分鐘。每孔加入0.4 mol/L NaOH 250μl終止反應。酶標儀上490 nm波長測吸光值(A)。

1.3.2 肝臟組織病理學 小鼠肝組織經(jīng)10%福爾馬林液固定后，經(jīng)脫水、透明和浸蠟包埋，制備石蠟組織切片。切片浸入PBS液中水化后，浸入蘇木精液中染色，經(jīng)0.1%鹽酸酒精分色，切片浸入1%的伊紅液中復染，后經(jīng)酒精脫色、二甲苯透明后，中性樹脂封固，鏡下觀察肝組織的變化。

1.3.3 ELISA法測定外周血 TNF-α 和 IFN-γ 選用對抗體強吸附的ELISA微孔反應板，先用包被緩沖液洗滌一次，拍干反應板。按試劑盒說明書將抗體用包被緩沖液稀釋到特定濃度，每孔加100μl后加封閉液250μl進行封閉。每孔加稀釋的血清樣品100μl;標準按說明書要求稀釋，每孔加100μl;空白孔僅加樣品稀釋液。每孔加一抗100μl，室溫1小時后，洗滌4次。加酶標二抗100μl，室溫1小時后，洗滌5次。每孔加底物100μl，室溫放置10～20分鐘，至標準孔的顏色達到適當?shù)纳疃葧r加終止液100μl終止反應，450 nm測吸光度。

1.3.4 肝臟淋巴細胞的分離及FACS分析

1.3.4.1 肝臟淋巴細胞的分離 參照我們以前分離肝臟淋巴細胞的方法［5］，主要為:小鼠摘眼球放血后脫臼處死，摘取肝臟。剪碎肝臟組織，用篩網(wǎng)研磨過濾，用Percoll淋巴細胞分離液提取分離肝臟淋巴細胞。

1.3.4.2 分離得到的小鼠肝臟淋巴細胞，用新鮮大鼠血清進行封閉，后加入FITC標記的NK1.1抗體和Cy標記的CD3抗體，避光染色后用流式細胞儀檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 對照組與各實驗組均采用t檢驗分析，P＜0.05為有顯著意義。

圖1 淫羊藿苷對ConA所致肝臟損傷小鼠血清中ALT和AST的影響變化Fig.1 Effects of Icariin on the serum levels of ALT and AST in mice injected with ConA

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對小鼠外周血ALT和AST水平的影響 ALT和AST是肝細胞中兩種重要的酶，ConA可引起小鼠肝臟損傷，及外周血中ALT和AST水平升高。圖1為淫羊藿苷實驗組、ConA對照組和淫羊藿苷對照組小鼠注射ConA后8、16、24、32小時外周血中ALT和AST動態(tài)變化。結(jié)果顯示，淫羊藿苷可明顯降低由ConA引起的小鼠血清中ALT和AST水平。

圖2 肝組織H＆E染色觀察淫羊藿苷對ConA引起的小鼠肝臟損傷的保護作用(×400)Fig.2 Effect of Icariin protected ConA-induced liver damage in mice by hematoxylin/eosin method(×400)

圖3 ELISA法檢測小鼠注射ConA后外周血中IFN-γ和TNF-α的表達變化Fig.3 The changes of IFN-γ and TNF-α level in the serum of mice treated with Icariin prior ConA or ConA alone detected by ELISA

2.2 淫羊藿苷對ConA所致小鼠肝臟病理損傷保護作用 淫羊藿苷對照組可見肝小葉、肝細胞索和肝竇排列規(guī)則清晰，細胞核仁大而圓，分布均勻(圖2A)。ConA對照組肝臟血管內(nèi)皮有淋巴細胞和紅細胞浸潤，肝細胞和內(nèi)皮細胞充滿氣泡，肝細胞核固縮，部分核膜破裂，肝組織有灶性和碎片樣壞死，其中12～16小時期間肝臟損傷最嚴重，呈現(xiàn)肝組織大片壞死(圖2B);淫羊藿苷實驗組小鼠肝組織有少量淋巴細胞和紅細胞浸潤，肝細胞核完整，未見有肝組織壞死區(qū)域(圖2C)，提示淫羊藿苷提前干預可明顯減輕由ConA引起的肝臟損傷。

圖4 小鼠注射ConA后肝臟淋巴細胞的變化趨勢Fig.4 Changes of liver NKT cells in different time after the mice administration with ConA

2.3 淫羊藿苷對肝臟損傷小鼠TNF-α和IFN-γ的影響 ConA可引起小鼠肝臟NKT細胞活化，分泌IFN-γ、TNF-α/β、IL-1、IL-2、IL-4 等細胞因子，誘導肝細胞壞死。圖3為ELISA酶聯(lián)試劑盒檢測的淫羊藿苷對ConA誘導的肝損傷小鼠外周血中IFN-γ和TNF-α含量影響變化。結(jié)果顯示:淫羊藿苷實驗組小鼠外周血中IFN-γ和TNF-α含量低于ConA對照組=3 ～5，P ＜0.05。

2.4 淫羊藿苷對肝臟淋巴細胞活化影響的研究 NKT細胞為ConA誘導肝臟損傷的靶細胞，ConA小鼠尾靜脈注射給藥后，引起肝臟淋巴細胞活化及T細胞亞群匯聚并浸潤肝臟造成損傷。本實驗利用FACS技術觀察淫羊藿苷對小鼠注射ConA后肝臟NKT、NK、CD3+T細胞的變化。圖4顯示，淫羊藿苷實驗組小鼠和ConA對照組小鼠在不同時間點肝臟淋巴細胞的變化趨勢。

3 討論

肝臟是機體的代謝和解毒器官，同時肝臟還具有內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)功能。肝臟是胸腺以外T細胞分化的重要場所，可參與機體的局部或整體水平的免疫調(diào)節(jié)。研究表明肝臟中含有大量的NK、NKT和γδT天然免疫細胞，其中NK細胞的含量占肝臟總淋巴細胞50%以上，NKT和γδT細胞超過外周血的含量，因此有專家提出肝臟可能是機體最大的專職天然免疫功能的器官［2］。病毒最易侵襲肝臟，肝臟T淋巴細胞是病毒侵襲肝臟的靶細胞，T淋巴細胞在病毒性和自身免疫性肝炎的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［6］。肝臟的損傷涉及肝細胞的死亡和再生，而肝細胞的生死又直接受到肝組織中其它非肝細胞尤其是免疫細胞的影響。自1992年Tiegs等［2］用ConA建立小鼠免疫性肝損傷模型以來，人們還發(fā)現(xiàn)其它免疫介質(zhì)(LPS、Poly I:C)等也可引起小鼠肝臟免疫性損傷［7］，這些肝損傷與人體病毒性肝炎免疫致病機理相類似，眾多學者借助該類模型來研究肝病的發(fā)病機理和開發(fā)治療肝炎的有效藥物。ConA可引起小鼠肝臟 NKT細胞活化，分泌 IFN-γ、TNF-α/β、IL-1、IL-2、IL-4 等細胞因子，并招募其它臟器 T細胞亞群浸潤肝臟，導致肝臟炎癥損傷，同時由于肝臟的生理結(jié)構及免疫介質(zhì)的作用也易導致肝臟產(chǎn)生ConA 的免疫耐受［8］。

Takamoto等［9］在比較研究ConA對雄性和雌性小鼠的損傷時發(fā)現(xiàn)雄性激素可使感染小鼠血漿中ALT和AST水平明顯低于雌性激素組。淫羊藿可強腎壯陽、扶正固本，具有雄性激素樣作用，淫羊藿苷為淫羊藿的提取物，可下調(diào)cGMP系統(tǒng)和上調(diào)cAMP系統(tǒng)，使cAMP/cGMP的比值升高，已證明淫羊藿苷的次級產(chǎn)物淫羊藿次苷可促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，而其一定劑量又可抑制淋巴細胞的增殖，具有雙相免疫調(diào)節(jié)作用［3］。本研究用淫羊藿苷對小鼠進行干預，隨后注射ConA，觀察淫羊藿苷對小鼠肝臟損傷的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷干預后小鼠血漿中ALT和AST水平明顯低于未進行干預的小鼠的水平。肝臟組織HE染色結(jié)果顯示ConA對照組小鼠肝臟血管內(nèi)皮有淋巴細胞浸潤，肝細胞和內(nèi)皮細胞充滿氣泡，肝組織有灶性和碎片樣壞死，而淫羊藿苷干預實驗組小鼠肝組織僅有少量淋巴細胞浸潤，但肝細胞核完整，未見肝組織壞死。經(jīng)進一步檢測淫羊藿苷實驗組及ConA對照組小鼠外周血中IFN-γ和TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷干預組小鼠外周血IFN-γ和TNF-α含量明顯低于ConA對照組。對小鼠注射ConA后肝臟中NKT、NK、T細胞亞群在不同時間點進行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷干預實驗組小鼠肝臟中NKT細胞的比率在多個時間點均低于ConA對照組小鼠的比率。

綜上所述，淫羊藿苷對ConA引起的小鼠肝損傷具有明顯的保護作用，其作用機理可能與延緩由ConA引起的肝臟NKT細胞活化及降低外周血中IFN-γ和TNF-α水平有關。

1 Norris S，Collins C，Doherty D G et al.Resident human hepatitis lymphocytes are phenotypically different from circulating lymphocytes［J］.J Hepatol，1998;28(1):84-96.

2 Tiegs G，Hentschel J，Wendel A.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A ［J］.J Clin Invest，1992;90(1):196-203.

3 程 堅，張新民，陳偉華et al.淫羊藿次苷Ⅱ?qū)π∈笃⒘馨图毎w外增殖的影響及其機制研究［J］.中國免疫學雜志，2012;28(4):323-327.

4 Zhou J，Wu J，Chen X et al.Icariin and its derivative，ICT，exert anti-inflammatory，anti-tumor effects，and modulate myeloid derived suppressive cells(MDSCs)functions ［J］.Int Immunopharmacol，2011;11(7):890-898.

5 Feng C，Wang H，Yao C et al.Diammonium glycyrrhizinate，a component of traditional Chinese medicine Gan-Cao，prevents murine T-cell-mediated fulminant hepatitis in IL-10-and IL-6-dependent manners［J］.Int Immunopharmacol，2007;7(10):1292-1298.

6 Emoto M，Kaufmann SH.Liver NKT cells:an account of heterogeneity［J］.Trends Immunol，2003;24(7):364-369.

7 Dong Z，Wei H，Sun R et al.Involvement of natural killer cells in PolyI:C-induced liver injury ［J］.J Hepatol，2004;41(6):966-973.

8 Erhardt A，Tiegs G.Tolerance induction in response to liver inflammation ［J］.Dig Dis，2010;28(1):86-92.

9 Takamoto S，Nakamura K，Yoneda M et al.Gender-related differences in concanavalin A-induced liver injury and cytokine production in mice［J］.Hepatol Res，2003;27(3):221-229.