抑制c-FLIPL表達(dá)增強(qiáng)rhTRAIL蛋白殺傷肺癌A549細(xì)胞的研究①

譚 巖 劉 磊 方艷秋 蔣永興 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春130021)

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是一種天然的殺傷腫瘤細(xì)胞因子，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。我們研究證實(shí)rhTRAIL蛋白可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)H460wt細(xì)胞株發(fā)生細(xì)胞凋亡，但A549細(xì)胞株表現(xiàn)出對(duì)rhTRAIL蛋白的耐藥現(xiàn)象，限制了TRAIL分子在臨床研究中的廣泛應(yīng)用［1］。FADD類白介素1轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白(FADD like interleukin-1 converting enzyme inhibitory protein c-FLIP)是一類高度保守的凋亡抑制基因，因與caspase-8含有相同死亡效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，從而參與抑制了TRAIL激活的凋亡信號(hào)途經(jīng)。c-FLIP表達(dá)兩種蛋白產(chǎn)物，55 kD的c-FLIPL(長(zhǎng)鏈)和28 kD的c-FLIPS(短鏈)。c-FLIPL被證實(shí)是影響TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性的重要因素［2，3］。抑制c-FLIPL的蛋白表達(dá)和/或活性可能是重新激活TRAIL誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的重要方法。本文以A549細(xì)胞株為研究對(duì)象，分別選用c-FLIPL活性化學(xué)抑制劑他莫昔芬和c-FLIPL基因特異性siRNA靶向作用于cFLIPL，探討抑制c-FLIPL活性增強(qiáng)rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549株由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。rhTRAIL蛋白由本研究室表達(dá)、純化［1］。IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司)小牛血清(杭州四季青生物材料公司)。總RNA提取TRIZOL試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);RT-PCR相關(guān)試劑(Promega公司);c-FLIPL和β-actin引物(北京鼎國(guó)合成);他莫昔芬Tamoxifen(Sigma公司);鼠抗人anti-caspase-8、鼠抗人 anti-cFLIPL、兔抗人 β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma)生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(購(gòu)自北京晶美公司)。

1.2 c-FLIPL靶向RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建含有c-FLIPL的 siRNA序列表達(dá)載體 pslincer3.1/c-FLIPL。將 A549細(xì)胞接種于 6孔板，重組質(zhì)粒pslincer3.1/c-FLIPL、pslincer3.1/NC(陰性對(duì)照)、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞以脂質(zhì)體Lipofectamine2000輔助轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(質(zhì)?！弥|(zhì)體=1∶3)，各設(shè)3復(fù)孔。

1.3 RT-PCR測(cè)定c-FLIPL的mRNA含量 于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集A549細(xì)胞，TRZOL試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，RT-PCR測(cè)定c-FLIPL的mRNA含量。分別設(shè)計(jì)c-FLIPL(大小為700 bp)引物(p1，p2)及內(nèi)參β-actin(大小266 bp)引物(p3，p4)，引物序列分別為:P1:5'-TGATGGCAGAGATTGGTGAG-3';P2:5'-GGCATGAATCTCCCATGAAC-3;P3:5'-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3';P4:5'-AGAGGCATACAGGGACAGC-3'。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5分鐘;94℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)30次;72℃終延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，應(yīng)用HVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)對(duì)目的基因和β-actin特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行密度掃描，計(jì)算出密度比值，比較c-FLIPL在基因水平的表達(dá)差異。

1.4 Western blot測(cè)定 c-FLIPL的蛋白含量 收取各組細(xì)胞并用裂解液獲取總蛋白，測(cè)定各組細(xì)胞蛋白含量并將蛋白樣品濃度調(diào)整為10μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，10%脫脂奶封閉液1小時(shí)。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的小鼠抗c-FLIPL工作液，4℃振搖孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液室溫下孵育2小時(shí)。TBST液洗膜×3次，加入50μl DAB，室溫下顯色15分鐘。以 β-actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)各組細(xì)胞c-FLIPL蛋白表達(dá)情況。

1.5 他莫昔芬抑制c-FLIPL表達(dá) 將5×105ml-1NSCLC A549株接種于6孔板，25μg/ml他莫昔芬作用于A549細(xì)胞6小時(shí)后，免疫印跡觀察A549細(xì)胞c-FLIPL蛋白水平(方法同1.4)。

1.6 caspase-8 活化的檢測(cè) Western blot測(cè)定pslincer3.1/c-FLIPL+rhTRAIL(100 ng/ml) 和 25 μg/ml他莫昔芬+rhTRAIL(100 ng/ml)作用A549細(xì)胞后caspase-8活化情況(方法同1.4)。

1.7 A549細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞 A549接種于6孔板中，貼壁后分別用rhTRAIL(100 ng/ml)、pslincer3.1/c-FLIPL+rhTRAIL(100 ng/ml)、25μg/ml他莫昔芬 +rhTRAIL(100 ng/ml)作用，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集A549細(xì)胞行Annexin-V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖抑制率 將5×105ml-1NSCLC A549株細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔100μl。貼壁后分別用pslincer3.1/c-FLIPL+rhTRAIL(100 ng/ml)和25μg/ml他莫昔芬 +rhTRAIL(100 ng/ml)作用，每組設(shè)3平行孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入新配制的5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清后加150μl DMSO溶解，混勻后在490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

2 結(jié)果

2.1 序列特異性RNAi對(duì)c-FLIPL表達(dá)的影響 構(gòu)建好的載體pslincer3.1/c-FLIPL經(jīng)Takala測(cè)序，插入片段的序列與所設(shè)計(jì)的shRNA序列完全一致。本研究中設(shè)計(jì)了3種FLIPL-siRNAs質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染效率基本相同情況下，針對(duì)于FLIPL的mRNA序列535-555的FLIPL-siRNAs質(zhì)粒對(duì)FLIPL抑制作用最強(qiáng)。轉(zhuǎn)染pslincer3.1/c-FLIPL后24小時(shí)時(shí)FLIPL-mRNA表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pslincer3.1/NC細(xì)胞組明顯降低(圖1)。免疫印跡觀察轉(zhuǎn)染pslincer3.1/c-FLIPL后48小時(shí)時(shí)c-FLIPL蛋白水平也顯著下調(diào)(圖2)。

2.2 他莫昔芬對(duì)A549細(xì)胞中FLIP表達(dá)的影響

蛋白印跡結(jié)果表明，他莫昔芬作用6小時(shí)后，A549細(xì)胞中FLIP-L蛋白表達(dá)量顯著降低(圖3)。

2.3 抑制c-FLIPL活性對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中FLIPL的mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Expression of FLIPL mRNA in A549 cells after siRNAs transfectiom

圖2 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中FLIPL的蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Expression of FLIPL in A549 cells infected by siRNAs

圖3 他莫昔芬作用后A549細(xì)胞中c-FLIPL的蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of c-FLIPL in A549 cells infected by tamoxifen

通過應(yīng)用免疫印跡方法分析各組caspase-8的活化情況(圖4)表明，應(yīng)用siRNAi-c-FLIPL和他莫昔芬均可有助于55 kD的caspase-8蛋白活化成為具有催化活性43 kD的caspase-8，有利于促進(jìn)rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。通過流式細(xì)胞分析，我們進(jìn)一步證實(shí)，caspase-8的活化有利于rhTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞促凋亡作用，較單獨(dú)應(yīng)用rhTRAIL蛋白相比，siRNA-c-FLIPL+rhTRAIL和Tamoxifen+rhTRAIL平均凋亡率分別為64.5%和59.2%(n=3)，顯著高于 rhTRAIL 蛋白組 2.5%(n=3)，抑制c-FLIPL表達(dá)是激活A(yù)549細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的有效手段(圖5)。

圖4 蛋白印跡檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)caspase-8表達(dá)情況Fig.4 Expression of caspase-8 in A549 cells infected by tamoxifen

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率Fig.5 Flow cytometric analysis of apoptotic rate of A549 cells

2.4 抑制c-FLIPL活性對(duì)A549細(xì)胞的殺傷的研究

單獨(dú)應(yīng)用rhTRAIL(100 ng/ml)作用A549細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率僅為(6.96±0.17)%。他莫昔芬作用6小時(shí)后，rhTRAIL(100 ng/ml)對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加到(73.2±1.54)%;轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNAs質(zhì)粒48小時(shí)后，rhTRAIL(100 ng/ml)可使 A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加到(69.5±1.65)%，他莫昔芬和 siRNAs均能顯著增強(qiáng)rhTRAIL對(duì)A549細(xì)胞的殺傷活性(P＜0.05)，抑制細(xì)胞內(nèi)c-FLIPL表達(dá)顯著增強(qiáng)了rhTRAIL蛋白對(duì)腫瘤增殖的抑制作用。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的70%～80%，化療療效不顯著，尋找安全有效的臨床用藥是目前NSCLC研究的熱點(diǎn)。rhTRAIL蛋白可以有效的殺傷NSCLC細(xì)胞，具有良好的應(yīng)用前景，而腫瘤耐藥株的出現(xiàn)制約了其在臨床治療研究中的廣泛應(yīng)用［4］。TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要是通過與NSCLC細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)途經(jīng)的活化［5］。研究證實(shí)，在多種耐藥細(xì)胞株中，某些凋亡抑制基因的過表達(dá)是導(dǎo)致凋亡信號(hào)終止的重要因素［6］。c-FLIP是一種DED調(diào)節(jié)蛋白，可以與caspase-8競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(Death-inducing signaling complex，DISC)，從而導(dǎo)致caspase-8不能被充分活化，而低水平的caspase-8蛋白不能促發(fā)TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤凋亡［7］。本研究證實(shí)，單獨(dú)應(yīng)用 rhTRAIL蛋白作用 A549細(xì)胞后，caspase-8未能夠很好的被活化成具有催化活性的分子量為43 kD的活性蛋白，其誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡率僅為2.5%，只能導(dǎo)致很少部分的腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，A549細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)rhTRAIL蛋白耐藥性。

抑制c-FLIP活性可能是實(shí)現(xiàn)rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要手段。siRNA被證實(shí)是可以有效的抑制c-FLIP基因表達(dá)的治療手段［8］，本研究中我們構(gòu)建了三段FLIP基因的特異性siRNA表達(dá)載體，經(jīng)過篩選獲得了一種能夠高效、特異抑制A549細(xì)胞內(nèi)FLIP基因和蛋白表達(dá)的干擾質(zhì)粒，通過RT-PCR方法證實(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在24小時(shí)后，F(xiàn)LIP的mRNA水平顯著降低，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后其蛋白水平也顯著降低，是繼續(xù)應(yīng)用rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的適合時(shí)機(jī)，此時(shí)rhTRAIL蛋白可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可以通過干擾雌激素與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，被廣泛用于乳腺癌的化療應(yīng)用中［9］。研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬還具有抑制膽管癌細(xì)胞內(nèi)FLIP蛋白的活性的功能［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的他莫昔芬作用于A549細(xì)胞后，caspase-8能夠得到很好的活化，rhTRAIL蛋白進(jìn)一步作用于細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率顯著降低，他莫昔芬可能是通過抑制FLIP蛋白的活性后，消除了FLIP蛋白競(jìng)爭(zhēng)caspase-8蛋白結(jié)合到FADD復(fù)合體中，rhTRAIL蛋白可以重新激活caspase-8蛋白的活化，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)途經(jīng)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本研究通過抑制c-FLIPL蛋白的表達(dá)促進(jìn)了rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)耐藥株A549細(xì)胞凋亡。分別從mRNA和蛋白水平均成功的抑制了FLIP的表達(dá)，誘導(dǎo)了caspase-8蛋白的再次活化和凋亡信號(hào)通路的開放，促進(jìn)了rhTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，但差異不顯著(P＞0.05)，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)篩選最佳劑量和效應(yīng)時(shí)間來證明哪一種方案更適合應(yīng)用研究。

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