紅曲E-70及洛伐他汀對乳腺癌細胞MCF-7的增殖影響

馮榮潔 吳 鐵

廣東醫(yī)學院藥理教研室，廣東 湛江 524023

紅曲是紅曲霉菌（monascus purpureus）經(jīng)液體深層發(fā)酵精致而成的一種純天然、有益于人體健康的食品添加劑，也被稱為天然他汀，是降血脂的天然保健品，洛伐他汀被認為是其主要的藥效成分。近年來國內外學者發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀對乳腺癌有明顯地抑制腫瘤細胞增殖的作用[1-4]。但天然紅曲是否也有抗癌作用，至今未有報道，本實驗觀察天然紅曲70%乙醇提取物（紅曲E-70）對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖影響，探討該成分是否有抑制乳腺癌的作用，同時，與洛伐它汀進行比較，了解紅曲的其他天然成分對洛伐他汀的抗癌作用是否有協(xié)同作用，為天然紅曲作為預防乳腺癌的保健食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與癌細胞

①紅曲E-70：天然紅曲（東莞市天益生物工程有限公司提供）70%乙醇提取工藝為天然紅曲30 g，70%乙醇浸泡12 h，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后得70%乙醇提取物；②洛伐他汀：中國藥品生物制品檢定所；③人乳腺癌細胞MCF-7：來自ATCC，10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)，隔天換液，3～5 d傳代。

1.2 紅曲E-70水溶液中的洛伐他汀含量測定

1.2.1 供試液的制備 紅曲E-70 11.87 mg，用蒸餾水溶解定容至5 mL，過濾后待用。

1.2.2 標準液的制備 精密稱取洛伐他汀對照品0.40 mg，甲醇溶解定容至5 mL，超聲；以此濃度用甲醇稀釋成以下濃度，并定容至 5 mL，使終濃度為 0.005、0.01、0.02、0.04 mg/mL，過濾后待用。

1.2.3 色譜條件 流動相： 甲醇∶0.002%磷酸溶液 （75∶25）；流速：1 mL/min；色譜柱為 kromasil C-18；柱溫：30℃；檢測波長：238 nm；進樣量：10 μL。

1.2.4 每毫升紅曲E-70提取液中洛伐他汀含量的計算 用標準曲線法求出紅曲E-70水溶液里洛伐他汀的含量。

1.3 癌細胞增殖抑制實驗（MTT法）

將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶消化后，以10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液制成5×104個/mL的細胞懸液，然后以每孔100 μL接種到96孔板上，在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，然后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后再更換培養(yǎng)液；紅曲E-70組加入不同濃度的紅曲E-70 100 μL，終濃度分別為： 1、10、50、100、150 μg/mL；洛伐他汀組加入洛伐他汀對照品，其加入量為換算后紅曲E-70中洛伐他汀含量的相同劑量，用無水乙醇溶解 （無水乙醇最大體積為0.0078%，本實驗已經(jīng)證明此體積含量對MCF-7的增殖無影響），即終濃度為 0.001、0.01、0.05、0.1、0.15 μg/mL；對照組加入等體積的培養(yǎng)液；空白對照組不加細胞，加入等體積的培養(yǎng)液，每一樣品均設4個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔以PBS洗1次，加入100 μL新的無血清培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液（濃度為5 mg/mL），輕振培養(yǎng)板。放回培養(yǎng)箱內再孵育4 h后，吸棄上清液，每孔中加二甲基亞砜100 μL，置于暗處振蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度（OD值），測定波長為490 nm。存活率計算公式為：存活率（%）=[（實驗組 OD值-空白對照組 OD值）/（對照組 OD值-空白對照組OD值）]×100%。本實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅曲E-70中洛伐他汀含量測定結果

以進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明：在0.005～0.08 mg/mL范圍內有良好的線性關系，回歸方程為 y=612 53x-4.049 3，R2=0.999 9（圖 1），紅曲E-70水溶液的峰面積為149.428 18，代入回歸方程后得其濃度為0.002 50 mg/mL。紅曲E-70的濃度為2.37 mg/mL，據(jù)此求出每1毫克紅曲E-70中含有洛伐他汀0.001 mg。由圖2可知，洛伐他汀的出峰時間在12 min左右，圖3在12 min左右也有洛伐他汀峰，證明紅曲E-70中含有洛伐他汀。

圖1 洛伐他汀標準曲線

圖2 洛伐他汀對照品HPLC

圖3 紅曲乙醇提取物HPLC

2.2 細胞形態(tài)學觀察藥物對MCF-7細胞的抑制作用

倒置顯微鏡下觀察經(jīng)過不同處理組中的MCF-7細胞形態(tài)變化（圖4A～G）。對照組細胞生長狀況良好，透明度大，折光性強，細胞形態(tài)呈多邊形且連成片；經(jīng)不同濃度紅曲E-70處理后的MCF-7，生長狀況差，折光性弱，貼壁細胞皺縮，變圓，隨著功能紅曲乙醇提取物濃度的增加，皺縮，變圓的程度增加，有些甚至脫落，漂??；而洛伐他汀只有0.15 μg/mL組有部分細胞皺縮，變圓。

圖4 倒置顯微鏡觀察MCF-7細胞形態(tài)（10×10）

2.3 紅曲E-70對MCF-7增殖率的影響

與對照組相比，紅曲E-70在1～150 μg/mL對MCF-7均有抑制作用，50～150 μg/mL對MCF-7的抑制作用尤其明顯（P<0.05或P<0.01）；而經(jīng)換算后加入相應量的洛伐他汀組，其對MCF-7的抑制作用不明顯，與對照組相比，只有0.15 μg/mL濃度組對MCF-7的抑制作用有顯著差異（P<0.05）。見表1。

3 討論

3.1 紅曲E-70對人乳腺癌MCF-7的抑制作用

紅曲E-70在1～150 μg/mL濃度范圍內對MCF-7均有抑制作用，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），隨著濃度增大，其抑制作用更加明顯，尤其在50～150μg/mL濃度范圍內（P<0.01）。細胞形態(tài)觀察也表明，隨著紅曲E-70濃度的增加，細胞皺縮、變圓的程度增加，甚至出現(xiàn)細胞脫落，漂浮。有研究報道，紅曲黃色素Ankaflavin對人肝癌細胞Hep G2和人肺癌細胞A549具有誘導凋亡作用[5]。也有學者報道，紅曲橙色素OR能有效地抑制人胃癌細胞AGS的增殖，與常用的腺癌臨床治療藥物紫杉醇相比，橙色素OR對人胃癌細胞株AGS生長的抑制效果更為顯著，且對人正常胃上皮細胞（GES-1）的毒性作用較小[6]。丁紅梅[7]觀察到紅曲多糖對小鼠S180肉瘤生長有明顯的抑制作用，且高劑量組免疫器官脾臟質量顯著增加，表明紅曲多糖有抗腫瘤作用。但紅曲對人乳腺癌MCF-7的抑制作用至今沒有報道，筆者研究證明，紅曲E-70對乳腺癌細胞有明顯的抑制作用。這種作用可能與其含有豐富的紅曲橙色素、紅色素、黃色素、多糖等成分有關，具體抑制癌細胞增殖的成分，還有待進一步深入研究。

表1 紅曲E-70及洛伐他汀對MCF-7細胞增殖的影響（，n=4）

表1 紅曲E-70及洛伐他汀對MCF-7細胞增殖的影響（，n=4）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 濃度（μg/mL）培養(yǎng)時間24 h 48 h 72 h對照組紅曲E-70組1洛伐他汀組10 50 100 150 0.001 0.01 0.05 0.1 0.15 0.260±0.011 0.240±0.012*0.238±0.014*0.213±0.019**0.210±0.010**0.194±0.013**0.252±0.005 0.253±0.007 0.249±0.008 0.241±0.011 0.237±0.012*0.256±0.010 0.230±0.012*0.235±0.011*0.225±0.012**0.207±0.011**0.186±0.008**0.256±0.008 0.256±0.014 0.253±0.006 0.246±0.010 0.238±0.011*0.255±0.010 0.227±0.012*0.218±0.012**0.199±0.011**0.185±0.008**0.175±0.010**0.255±0.015 0.247±0.012 0.245±0.021 0.239±0.019 0.227±0.016*

3.2 紅曲E-70對人乳腺癌MCF-7的抑制作用優(yōu)于洛伐他汀

本實驗顯示，紅曲E-70抑制MCF-7增殖（P<0.05或P<0.01）。通過高效液相檢測紅曲E-70中的洛伐他汀含量，經(jīng)換算后，紅曲E-70最小有效量中，1 mL含有洛伐他汀0.001 μg，即洛伐他汀含量是紅曲E-70的千分之一。將紅曲E-70中對應量的洛伐他汀加入MCF-7中進行培養(yǎng)，結果顯示，紅曲中同劑量的洛伐他汀對MCF-7的增殖抑制作用不明顯，只有0.15 μg/mL組與對照組有顯著性差異（P<0.05）。已經(jīng)有報道，紅曲中主要成分之一洛伐他汀有抗腫瘤作用[8]。研究者分別以 4、8、16 μmol/L洛伐他汀處理 MCF-7細胞24～72 h后，流式細胞儀檢測細胞周期的時相分布及細胞凋亡率，硝基藍四氮唑（NBT）還原實驗鑒定細胞分化；研究結果提示，洛伐他汀對MCF-7細胞的影響主要是抑制細胞增殖和促進細胞分化，而誘導MCF-7細胞凋亡的作用不明顯，同時洛伐他汀還能將該細胞阻滯于G0/G1期，作用存在濃度-效應和時間-效應依賴關系。上述研究最小有效量4 μmol/L是筆者實驗中洛伐他汀最大劑量0.15 μg/mL的11倍左右，由此推測，紅曲E-70抑制MCF-7細胞增殖可能不是主要通過洛伐他汀起作用。 還有研究者以 5.93、20、40、80 μmol/mL洛伐他?。↙V）和 20、50、75、100、150、200、250、300 μg/mL 紅曲提取物（RYR）分別作用于HCT-116和 HT-29；結果發(fā)現(xiàn)，LV抑制HCT-116和 HT-29的細胞增殖（P<0.001）并誘導凋亡（P<0.05），RYR 抑制 HCT-116 和 HT-29 增殖（P<0.001），而且作用于HCT-116時能誘導凋亡（P<0.05）；在LV組加入甲羥戊酸（MV），改變其抑制HCT-116和 HT-29增殖的作用，而RYR組加入MV并沒有改變其抑制細胞增殖作用，而不含莫那可林K（MK）的紅曲提取物組也沒有改變LV介導的抑制細胞增殖作用[9]。以上結果提示，紅曲提取物的組成包括洛伐他汀、色素和影響其作用的多種成分，作用于癌細胞內的信號通路可能與純品洛伐他汀不同。在筆者實驗中，洛伐他汀組的有效劑量0.15 μg/mL是5.93 μmol/L的7%，而紅曲E-70的最小有效劑量（1 μg/mL）是以上研究RYR最小有效量（20 μg/mL）的 1/20。 洛伐他汀在 0.001～0.150 μg/mL濃度范圍內其抑制癌細胞增殖作用明顯沒有紅曲E-70（1～150 μg/mL）的作用好，與文獻報道相似，提示紅曲E-70和洛伐他汀抑制癌細胞增殖的信號通路不同。紅曲E-70里可能含有多種抗腫瘤活性物質活性成分，有可能可以通過不同的信號通路抑制癌細胞增殖，誘導其凋亡，但具體是哪些成分起抑制作用和相關信號通路抑制癌細胞增殖還有待進一步研究。

[1]羅遠瓊，糜漫天，許紅霞，等.洛伐他汀對BRCA1基因高表達MCF-7乳腺癌細胞p21的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2004，26（5）：386-389.

[2]羅遠瓊，糜漫天.CyclinD1/CDK4在洛伐他汀抑制裸鼠乳腺癌移植瘤增殖中的作用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2006，28（4）：319-323.

[3]王芳，糜漫天，韋娜，等.洛伐他汀對轉染乳腺癌細胞增殖功能的影響[J].中國公共衛(wèi)生，2005，4（21）：506-508.

[4]韋娜，糜漫天，張乾勇，等.洛伐他汀對MCF-7細胞核轉錄因子和細胞周期調控蛋白表達的影響[J].中華腫瘤雜志，2003，25（4）：332-334.

[5]Su NW，Lin YL，Lee MH，et al.Ankaflavin from monascus-fermented red rice exhibits selective cytotoxic effect and in induces cell death on hep-G2 cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53：1949-1954.

[6]鄭允權，信亞文，石賢愛，等.紅曲橙色素對人胃腺癌細胞AGS誘導凋亡的作用[J].福州大學學報：自然科學版，2010，38（6）：922-926.

[7] 丁紅梅.紅曲多糖抑瘤作用初步研究[J].菌物研究，2007，5（3）：171-173.

[8]周永，糜漫天，朱俊東，等.洛伐他汀對MCF-7細胞增殖分化功能及間隙連接細胞通訊的影響[J].癌癥，2003，22（3）：257-261.

[9]Mee YH，Navindra P，Seeram，et al.Anticancer effects of Chinese red yeast rice versus monacolin K alone on colon cancer cells[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2008，19：448-458.