莊禧懿,儲衛(wèi)華,,馬興旺,朱 衛(wèi)
(1.中國藥科大學生命科學與技術學院,江蘇 南京 210009;2.南京日升康生物工程有限公司,江蘇 南京 211103)
紅曲霉菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)[1]。由紅曲菌接種于大米發(fā)酵得到的紅曲具有防腐、解毒、消食活血、健脾燥胃之功效[2],同時,紅曲菌具有很強的產色素能力,紅曲色素作為天然色素應用于食品著色歷史悠久。紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素[3,4]。急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、慢性毒性試驗和致突變試驗表明,紅曲色素無毒副作用和致突變作用。隨著人們對合成食品添加劑和化學藥物對人體毒副作用的認識,世界各國掀起了食用綠色食品和使用天然藥物的熱潮,紅曲作為藥食兼用的天然制品,引起了極大的關注。與化工合成的色素相比,紅曲色素具有安全性高、穩(wěn)定性好、色調柔和、pH值穩(wěn)定、對蛋白質的著色力強且兼具抗菌性等特點,是一種具有悠久應用歷史的天然色素[5,6]。
作者從市售不同紅曲發(fā)酵產品中分離得到紅曲霉純培養(yǎng)菌株,根據形態(tài)學特征進行屬和種的鑒定,并對其發(fā)酵產紅曲色素工藝進行初步研究,為進一步發(fā)掘紅曲菌生物資源做了有益探索。
市售功能性紅曲米粉,紅曲發(fā)酵飼料,紅腐乳等。
乳酸,無水乙醇。
高壓滅菌鍋,電熱恒溫培養(yǎng)箱,恒溫搖床,超凈工作臺,顯微鏡,UV-2100 型分光光度計等。
分離培養(yǎng)基:(1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基);(2)孟加拉紅培養(yǎng)基;(3)麥芽汁液體培養(yǎng)基加乳酸調pH值2.5,加10%(體積分數,下同)乙醇。
形態(tài)鑒定平板培養(yǎng)基:(1)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(Wa培養(yǎng)基);(2)察氏瓊脂培養(yǎng)基;(3)PDA培養(yǎng)基。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖90,蛋白胨30,KH2PO41.0,MgSO41.0,MnSO40.1,ZnSO40.1,pH值6.0。
1.3.1 紅曲霉菌株的分離
稱取10.0 g 紅曲粉,加入到90 mL帶玻璃球的無菌生理鹽水中,振搖10 min,10倍梯度稀釋。吸取0.1 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)3~7 d,挑取單菌落轉移接種到新的分離培養(yǎng)基培養(yǎng),經反復分離純化得到較純的菌株,保藏。
1.3.2 菌株形態(tài)學觀察
將篩選的菌株的孢子劃線接種到形態(tài)鑒定培養(yǎng)基平板上,放入培養(yǎng)箱中,30 ℃倒置培養(yǎng),每天觀察記錄各菌株的菌落形態(tài)。菌絲和孢子顯微結構的觀察采用插片培養(yǎng)法[7],將接種好的培養(yǎng)皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定期取出蓋玻片觀察其菌絲結構、繁殖結構等形態(tài)特征。
1.3.3 液體發(fā)酵及色價測定
制作液體發(fā)酵培養(yǎng)基,分裝到三角瓶中,裝液量為50 mL/250 mL,滅菌待用。無菌條件下將分離純化的菌株制成孢子懸液,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃、180 r·min-1下搖床培養(yǎng),考察接種量、培養(yǎng)基初始pH值等條件對產紅曲色素的影響。
紅曲色素的提取及其色價測定[8]:取發(fā)酵液5 mL,加入75%乙醇45 mL,靜置浸提4 h,過濾。濾液再以75%乙醇稀釋適當倍數后,以75%乙醇作空白對照,在波長510 nm處測定OD值。將OD值乘以稀釋倍數,即為紅曲色素色價(單位為 U·mL-1)。
將不同的紅曲產品接種到分離培養(yǎng)基上,經過一段時間的培養(yǎng),獲得了15株菌株, 其中一株肉眼可見產紅色素高于其它菌株,命名為RP-1。將RP-1孢子稀釋液涂布PDA培養(yǎng)基平板,30 ℃培養(yǎng),3~4 d 后可見白色團狀菌絲,7 d 后菌絲轉為紅色,紅色素擴散至整個培養(yǎng)基中(圖1)。
圖1 產紅色素霉菌在PDA培養(yǎng)基上的生長特征
在普通光學顯微鏡下觀察(圖2),RP-1的菌絲呈不規(guī)則型分枝,多核,有橫隔,含油滴,無色透明或含深淺不一的紅色素,分生孢子呈球形,著生于菌絲及其分枝的頂端,孢子單生或鏈狀,閉囊殼球形,有柄。根據菌落及顯微形態(tài),初步鑒定RP-1為紅色紅曲菌(Monascusruber)。
圖2 RP-1顯微形態(tài)特征(10×40)
2.3.1 接種量
接種量會對微生物生物量及代謝產物產生較大的影響。分別選用4種不同的接種量(1%、5%、10%和15%)進行實驗,經過7 d的培養(yǎng),結果發(fā)現,隨著接種量的增加,紅曲色素色價提高,當接種量為15%時,其色價達到126.0 U·mL-1。
2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值
pH值是微生物生長和產物合成過程中重要的生理參數之一,對微生物酶活有顯著的影響,同時還會引起細胞膜透性以及菌體形態(tài)的變化,從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收和代謝產物的分泌。培養(yǎng)基初始pH值分別設定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進行實驗,結果發(fā)現,當培養(yǎng)基初始pH值為4.0時,紅曲色素色價為47.8 U·mL-1;當培養(yǎng)基初始pH值為5.0時,紅曲色素色價有所上升,但不明顯;當培養(yǎng)基初始pH值為6.0時,其色價最高,達132.0 U·mL-1;而當培養(yǎng)基初始pH值為7.0時,其色價有所下降;當培養(yǎng)基初始pH值為8.0時,其色價為115.6 U·mL-1。這可能跟真菌的適宜生長pH值有關。因此,紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產紅曲色素的培養(yǎng)基最佳初始pH值為6.0。
2.3.3 討論
后家衡等[9]研究表明,接種量為5.0%、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時間為72 h、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時,3 株紅曲霉中以Mg 菌株產色素最高,并在以番薯粉為碳源的培養(yǎng)基中色素產量最高;而劉德華等[10]研究表明,5%~20%的接種量、培養(yǎng)基初始pH值7.0最有利于紅曲色素的合成。他們的研究結果與本研究有所差別,表明紅曲霉不同菌株產色素能力有著很大差異,優(yōu)化發(fā)酵條件可以顯著提高色素色價,因此進行色素高產菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化是十分有必要的。
從市售紅曲發(fā)酵產品中成功分離得到15株紅曲霉純培養(yǎng)菌株,其中一株肉眼觀察高產紅色素,通過形態(tài)特征觀察,初步鑒定該菌株為紅曲屬(Monascus)中的紅色紅曲菌(Monascusruber),命名為RP-1。下一步有必要對分離到的RP-1進行18S rDNA、GC含量測定以進行準確鑒定。
對紅曲霉RP-1的液體搖瓶發(fā)酵工藝進行了初步研究,結果發(fā)現,接種量以及培養(yǎng)基初始pH值等發(fā)酵參數對紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產紅曲色素色價有影響,接種量為15%、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時,最有利于紅曲色素的合成。
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