南極微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、分子鑒定及適應(yīng)性研究

杜 寧

(國家海洋局 第一海洋研究所 海洋活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島 266061)

微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的可使水中的懸浮顆粒、菌體及膠體粒子凝聚、沉淀的一類高效、安全的水處理劑[1～4]，其成分一般為糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等[5]。研究表明，極地微生物較常溫微生物的胞外分泌物分子量更大、成分更復(fù)雜[6～9]。因此，作者以極地微生物為篩選目標(biāo)，擬開發(fā)出在經(jīng)濟(jì)培養(yǎng)基、低溫環(huán)境下絮凝效率高、產(chǎn)量大的微生物絮凝劑。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

海水、海冰和底泥為作者在第25次南極科學(xué)考察中采集。

80目過篩高嶺土。

實驗所用試劑均為分析純。

721型可見分光光度計、磁力攪拌機、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀。

1.2 培養(yǎng)基

通用發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，NaCl 3.5 g，(NH4)2SO40.2 g，尿素 0.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH值6.8～7.2，120 ℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 絮凝劑產(chǎn)生菌的分離和篩選

分別取海水、海冰和底泥，在蛋白胨固體培養(yǎng)基上采用平板劃線法分離并純化以獲得純菌種。將分離到的菌種置于液體培養(yǎng)基中，于5 ℃、120 r·min-1、pH值7左右條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液測其絮凝率，將具有良好絮凝率的菌株作為復(fù)篩菌種。

1.3.2 活性菌株的分子鑒定

細(xì)菌總RNA提取，16S rRNA基因序列擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物，引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為2 μL，包括：1×PCR緩沖溶液、1.6 mmol·L-1MgCl2、4×dNTP混合物各100 μmol·L-1，引物各1.0 μmol·L-1，Taq RNA聚合酶1 U，模板RNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。將所測定菌株的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進(jìn)行相似性比較分析。

1.3.3 活性菌株碳、氮源適應(yīng)性研究

分別改變通用發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源，觀察活性菌株絮凝率的變化，考察其碳、氮源適應(yīng)性，篩選出在經(jīng)濟(jì)培養(yǎng)基條件下具有較高絮凝活性的菌株。

1.3.4 絮凝率測定

向100 mL燒杯中加入0.2 g高嶺土、1 mL絮凝劑樣品(微生物發(fā)酵液)、1 mL 1 g·mL-1的CaCl2溶液，加蒸餾水至總體積50 mL，調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0，置于磁力攪拌機上首先200 r·min-1下快攪1 min，然后80 r·min-1下慢攪4 min。靜沉2 min，吸取上清液測定其550 nm處吸光度，同時以蒸餾水代替發(fā)酵液作對照。以絮凝率(E)表示絮凝活性，按下式計算：

E=[(A-B)/A]×100%

式中：A為對照上清液的OD550值；B為樣品上清液的OD550值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

從海水、海冰和底泥中共分離、純化得到56株菌株，經(jīng)初篩得到有絮凝活性的菌株18株，再經(jīng)復(fù)篩和傳代培養(yǎng)，得到7株具有穩(wěn)定高絮凝活性菌株，見表1。

表1產(chǎn)微生物絮凝劑菌株篩選結(jié)果及其生存環(huán)境

Tab.1Thescreeningresultofmicrobialflocculant-producingbacteriaandtheirlivingenvironment

菌株來源溫度/℃鹽度/%水深/m絮凝率/%IS-11-10-1泥樣-1.733.738079.75I-2冰樣-10.012.1080.25I-1-2冰樣-10.012.1082.25P2-14-1泥樣-1.733.745252.50P2-14-2泥樣-1.733.745283.75P3-06-1泥樣-1.733.7297552.00P2-13-1泥樣-1.733.711483.25

從表1可看出，所篩選的7株活性菌株均來自泥樣和冰樣，表明南極產(chǎn)絮凝活性的微生物以生活在海冰冰層和底質(zhì)沉積物中為主。這是由于海冰冰層冰晶形成的脅迫以及底質(zhì)沉積物的影響造成了這些菌株胞外分泌物的多樣化與大量化，為分離純化具有絮凝活性的物質(zhì)提供了基礎(chǔ)。

2.2 活性菌株的16S rRNA序列分析

對篩選到的7株具有絮凝活性的南極細(xì)菌基因組RNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了長度約為1.4 kb的16S rRNA序列，經(jīng)比對分析后提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得其同源相似性比較結(jié)果，見表2。

表2 7株絮凝活性菌株16S rRNA序列同源性比較

從表2可看出，所分離到的7株活性菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫已有菌株的16S rRNA序列具有很高的相似度，均在99%以上；分別隸屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、沙雷菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。表明篩選到的南極活性細(xì)菌沒有專屬性，這與目前已報道的產(chǎn)絮凝劑微生物種類多達(dá)幾十種以上[10]相吻合。

從現(xiàn)有研究來看，微生物絮凝劑為多糖蛋白、粘多糖和纖維素等[11]。結(jié)合本實驗篩選到微生物的生存環(huán)境來看，正是由于南極惡劣的自然環(huán)境，迫使生活在其中的細(xì)菌需要在胞外分泌大量的活性物質(zhì)來抵御環(huán)境的侵害，而這類物質(zhì)同時也具備了絮凝活性，這為以后改變培養(yǎng)條件，刺激活性菌株提高絮凝活性提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 活性菌株的碳、氮源適應(yīng)性

2.3.1 碳源(表3)

表3 碳源對菌株絮凝活性的影響

從表3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中原有葡萄糖含量增加時，微生物的絮凝活性并沒有明顯提高，相反菌株P(guān)3-06-1失去了絮凝活性。以麥芽糖、乳糖和蔗糖作碳源時，雖然它們同屬最簡單的二糖，但是不同微生物將其降解成單糖葡萄糖的能力卻有著很大的差別，這對降低大規(guī)模發(fā)酵成本有著很大的參考意義。另外，以復(fù)雜的多糖(可溶性淀粉)為碳源時的絮凝活性為0，說明所篩選的微生物不具備降解多糖的能力，這可能是由于南極環(huán)境中碳源種類、含量較少。在最為廉價的蔗糖實驗中，菌株I-2、I-1-2、P2-14-1、P2-14-2和P2-13-1的絮凝率保持在80%以上，表明其具有碳源普適性。

2.3.2 氮源(表4)

表4 氮源對菌株絮凝活性的影響

從表4可知，南極產(chǎn)微生物絮凝劑活性菌對分子量小、結(jié)構(gòu)簡單的無機營養(yǎng)鹽有著更好的利用能力。在最為廉價的氯化銨實驗中，菌株P(guān)2-13-1、I-2的絮凝率分別為85.00%、41.06%；而在較廉價的硫酸銨實驗中，菌株I-2、P2-14-1和P2-13-1均表現(xiàn)出較高的絮凝率。表明菌株I-2和P2-13-1具有氮源普適性。

3 結(jié)論

從南極海水、海冰、底泥中分離得到7株產(chǎn)絮凝劑的菌株。分子鑒定表明，篩選到的南極活性細(xì)菌沒有專屬性，分別隸屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、沙雷菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。改變培養(yǎng)基中碳源和氮源的組成并觀察絮凝率的變化，篩選出在經(jīng)濟(jì)培養(yǎng)基條件下具有較高絮凝活性，同時對碳源和氮源具有普適性的菌株I-2和P2-13-1，可以作為下一步大規(guī)模發(fā)酵研究微生物絮凝劑的實驗菌種。

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