具有非對(duì)映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株篩選與鑒定

毛芳芳， 王亞軍， 羅 希， 魏積福， 鄭裕國

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程中心，浙江 杭州 310014)

冠狀動(dòng)脈心臟病是世界上造成死亡最主要的疾病之一。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年死于冠狀動(dòng)脈心臟病的人數(shù)超過760萬。流行病學(xué)研究證實(shí)冠狀動(dòng)脈心臟病與高膽固醇血癥有很大的關(guān)系。許多降膽固醇藥物被成功開發(fā)并上市[1]，其中阿托伐他汀鈣最暢銷，2008年銷售額達(dá)到300億美元[2]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀鈣的關(guān)鍵手性前體[3]，傳統(tǒng)的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯化學(xué)合成法不僅使用昂貴的硼烷類試劑和正丁基鋰，而且要在低于-60 ℃的條件下進(jìn)行反應(yīng)，消耗大量的能量和有機(jī)溶劑[4～6]。

生物轉(zhuǎn)化與生物催化提供了一種高效、溫和、環(huán)境友好、選擇性高的手性合成方法[7]。羰基還原酶普遍存在于細(xì)菌、酵母及真菌中，為生物不對(duì)稱還原酮酯制備光學(xué)純?chǔ)?羥基酯提供了一條有效的途徑，已成功應(yīng)用于化學(xué)制品、食品、農(nóng)用化學(xué)品和制藥工業(yè)等來制備手性醇[8]。然而，大多數(shù)天然羰基還原酶催化的不對(duì)稱還原都遵守Prelog法則，具有反Prelog法則的立體選擇性羰基還原酶十分稀少，其精確機(jī)理也尚不清楚[9]。作者篩選得到一株具有非對(duì)映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性的菌株X25 ，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并考察了其催化性能。合成機(jī)理見圖1。

圖1 羰基還原酶不對(duì)稱還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯標(biāo)準(zhǔn)品，Toronto化學(xué)制品研究公司；6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司；蛋白胨、酵母膏、瓊脂，市售生化試劑；其它試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖50.0，黃豆芽100.0 (稱取100.0 g黃豆芽，加水煮沸30 min后紗布過濾)，6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯11.4，pH值自然。

斜面培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖50.0，黃豆芽100.0 (稱取100.0 g黃豆芽，加水煮沸30 min后紗布過濾)，瓊脂20.0，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20.0，酵母膏20.0，NaCl 1.0， KH2PO42.5，(NH4)2HPO42.5，MgSO40.030， 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯0.2% (體積分?jǐn)?shù))，pH值7.0。培養(yǎng)基滅菌冷卻后添加6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，以誘導(dǎo)提高羰基還原酶活性。

酶活定義：在30 ℃、pH值7.0條件下，每分鐘催化生成1 μmol 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.3 菌株的篩選

用于菌株篩選的土樣采集于全國各地。稱取1.0 g土樣，分散到10.0 mL 0.85%(質(zhì)量濃度)生理鹽水中，移取2.0 mL土壤懸浮液接種至盛有28.0 mL富集培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。移取2.0 mL培養(yǎng)液接種至28.0 mL無菌富集培養(yǎng)基中，在上述條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。連續(xù)富集3次后稀釋涂固體平板，30 ℃培養(yǎng)至長出清晰的單菌落，挑取單菌落接種至斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)36 h后于4 ℃冰箱中保存。

斜面接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后取20 mL發(fā)酵液離心收集菌體檢測還原酶活性。挑選活力和選擇性最好的菌株X25，對(duì)其進(jìn)行分離純化鑒定。鑒定過的菌株用20%(體積分?jǐn)?shù))甘油保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.4 菌株鑒定

利用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)考察菌株X25對(duì)65種不同碳源的代謝情況。將菌株接種于酵母平板培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，用無菌棉簽將平板上的菌體轉(zhuǎn)移并分散于無菌水中，混勻，制成菌懸液，用濁度計(jì)調(diào)整透光率至47%。分別移取菌懸液至Biolog YT微孔鑒定板，每孔100 μL。將微孔鑒定板放在28 ℃培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后置于Biolog讀數(shù)儀上讀取結(jié)果。

分子鑒定首先提取X25的基因組DNA，利用引物pITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和pITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，在PTC-200型PCR儀 (Bio-Rad，USA)上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95 ℃，4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收目的DNA。根據(jù)T/A克隆步驟(Takara，日本)將得到的目的基因與pMD18-T載體連接[10]。將重組的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109[11]，然后在含有50 μg·mL-1氨卞青霉素的LB平板上生長。將陽性克隆記為E.coliJM109/pMD18-T-X25，并電泳檢測。E.coliJM109/pMD18-T-X25于37 ℃在含有氨卞青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，收集菌體，用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取質(zhì)粒后對(duì)基因序列進(jìn)行檢測。Blast所獲得的序列用于和GenBank 數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行對(duì)比。18S rDNA全序列用CLUSTAL W ver.1.81 A軟件包排序，用MEGAversion 2.1軟件包中的 Kimura2-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

1.5 轉(zhuǎn)化條件

取0.5 gP.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞分散于10 mL含20 g·L-1葡萄糖的磷酸緩沖溶液(pH值7.0，50 mmol·L-1)中，30 ℃預(yù)熱2.0 min后加入6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯 (終濃度10 g·L-1)?；靹颍?0 ℃反應(yīng)10 h，轉(zhuǎn)化過程中每隔2 h取樣0.8 mL，用100 μL HCl滅活，然后用同樣濃度的100 μL NaOH溶液中和，12 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm微濾膜過濾。取澄清濾液測定生成的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯濃度和殘余6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯濃度。

1.6 分析檢測

6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯及其非對(duì)映異構(gòu)體用LC-20AD型高效液相色譜儀(島津)檢測。色譜條件為：大連依利特Hypersil ODS2 C18柱 (4.6 mm×250 mm，2.5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(1∶3，體積比)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

對(duì)篩選得到的菌種進(jìn)行酶活和非對(duì)映選擇性檢測，發(fā)現(xiàn)菌株X25作用6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的羰基還原酶活性最強(qiáng)、非對(duì)映選擇性最高，產(chǎn)物構(gòu)型符合反Prelog法則。菌株X25細(xì)胞呈卵狀或瓜子狀，細(xì)胞大小(1.4～2.5) μm×(1.4～5.0) μm，在平板上形成圓形、乳白色、不透明、中間凸起、表面光滑的菌落(圖2)。Biolog鑒定結(jié)果見表1。

由表1可知，菌株X25能夠較好地利用42種碳源，對(duì)其它23種碳源不能利用或利用能力較弱?；贐iolog鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，菌株X25與PichiaguilliermondiiA標(biāo)準(zhǔn)菌株相似，相似性指數(shù)為1.000。

表1 菌株X-25對(duì)Biolog YT板上65種碳源的利用能力

注：+，陽性；-，陰性；B，交界。

圖2 菌株X25在豆芽汁平板上的菌落形態(tài)

提取菌株X25的18S rDNA，測序后，從Gen-Bank數(shù)據(jù)庫挑取與X25 18S rDNA 序列相似的序列，并用MegAlign 軟件(DNASTAR公司，美國)繪制進(jìn)化發(fā)育樹(圖3)。將獲得的序列與GenBank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株X25與Pichiaguilliermondii(FJ 969194.1)同源性最高 (100%/607 bps，18S rDNA)。因此，菌株X25屬于Pichia屬的Guilliermondii種，中文名稱為季也蒙畢赤酵母。基于生理生化特征與18S rDNA分子鑒定，菌株X25被鑒定為季也蒙畢赤酵母。該菌株保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號(hào)CCTCC M 2011386。

圖3 菌株X25的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

2.2 P.guilliermondii X25發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

將P.guilliermondiiX25接種于常用畢赤酵母培養(yǎng)基，每隔2 h取樣分析發(fā)酵液羰基還原酶活性，結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)P.guilliermondii X25生物量、羰基還原酶活性和非對(duì)映選擇性的影響

由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)P.guilliermondiiX25羰基還原酶活性、非對(duì)映選擇性和生物量影響顯著，培養(yǎng)40 h后，P.guilliermondiiX25 發(fā)酵液羰基還原酶活性達(dá)到峰值，約24.79 U·L-1。在整個(gè)培養(yǎng)進(jìn)程中，非對(duì)映選擇性介于11.7～15.4之間，表明P.guilliermondiiX25具有較好的非對(duì)映選擇性。

2.3 溫度、pH值對(duì)P.guilliermondii X25靜息細(xì)胞羰基還原酶活性的影響

溫度、pH值對(duì)P.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞羰基還原酶活性的影響見圖5。

圖5 溫度(a)、pH值(b)對(duì)P.guilliermondii X25靜息細(xì)胞羰基還原酶活性的影響

由圖5可知，在溫度22～43 ℃范圍內(nèi)，P.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞表現(xiàn)出較好的非對(duì)映選擇性，產(chǎn)物de值在90%左右，35 ℃時(shí)P.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞羰基還原酶活性達(dá)到最高，約44.3 U·L-1，溫度超過37 ℃時(shí)，酶活性急劇下降(圖5 a)；在pH值5.0～8.0范圍內(nèi)，P.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞羰基還原酶具有較好的活性和非對(duì)映選擇性，在pH值7.0的磷酸緩沖溶液中酶活性最高，達(dá)到74.04 U·L-1(圖5b)。

2.4 P.guilliermondii X25非對(duì)映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯

P.guilliermondiiX25非對(duì)映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯進(jìn)程曲線見圖6。

圖6 P.guilliermondii X25非對(duì)映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯進(jìn)程

由圖6可知，轉(zhuǎn)化1 h時(shí)，底物6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯轉(zhuǎn)化率為3.4%，產(chǎn)物6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值接近100%；隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長，6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯濃度顯著降低，然而6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值隨即降至90.4%。這與P.guilliermondiiX25的非對(duì)映選擇性介于11.7～15.4之間有關(guān)，高的底物轉(zhuǎn)化率導(dǎo)致低的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值。

3 結(jié)論

從自然環(huán)境中篩選獲得一株對(duì)6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯具有羰基還原酶活性的菌株X25，結(jié)合表型特征、生理生化特征和分子遺傳學(xué)鑒定，該菌株屬于Pichiaguilliermondii。利用P.guilliermondiiX25靜息細(xì)胞成功建立了光學(xué)純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的生物催化合成工藝，最佳催化條件為35 ℃、pH值7.0；在低底物轉(zhuǎn)化率時(shí)，能夠制備光學(xué)純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯。豐富了他汀類藥物關(guān)鍵手性側(cè)鏈的合成技術(shù)。鑒于P.guilliermondiiX25羰基還原酶的活性和非對(duì)映選擇性仍有提升空間，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)該羰基還原酶進(jìn)行后續(xù)分子改造十分必要。

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